Содержание
Чтобы спланировать ПЦР-тест, необходимо знать строение искомой нуклеиновой кислоты, т.е. последовательность нуклеотидов того участка, который подлежит амплификации. Установив это, синтезируются два коротких ДНК-зонда (праймеры) с таким расчетом, чтобы они могли вступить в гибридизацию с комплементарными участками ДНК-мишени (рис. 4). Тест-система включает ДНК, выделенную из исследуемого материала, праймеры, дезоксирибонуклеотиды (в виде трифосфатов) и термостабильную ДНК-полимеразу (продукт термофильных бактерий Thermus aquaticus). Реакционная смесь подвергается повторным циклам нагревания-охлаждения, во время которых совершается денатурация ДНК (нагревание), гибридизация/отжиг праймеров (охлаждение) и синтез ДНК. В первом цикле происходит дупликация фрагмента ДНК, ограниченного праймерами, причем каждая из разобщенных ДНК-нитей служит матрицей для синтеза второй, комплементарной нити ДНК, начиная от связанного праймера. При синтезе (полимеризации) очередной ДНК-нити генерируется и новый участок для связывания праймера. Это означает, что любая вновь синтезированная нить становится матрицей для последующих синтетических циклов, инициируемых праймерами. Число копий амплифицируемого ДНК-фрагмента (а, следовательно, и ДНК-матриц для последующего синтеза) с каждым циклом удваивается, нарастая в геометрической прогрессии (отсюда — цепная реакция). В этом отношении ПЦР аналогична естественной репликации ДНК в делящихся клетках, но в ПЦР экспоненциальный синтез ДНК лимитирован фрагментом, на котором фиксирован искусственно синтезированный праймер. Продукты ПЦР (ампликоны) идентифицируют при помощи гелевого электрофореза или путем гибридизации с ДНК-пробой, комплементарной амплифицируемому фрагменту ДНК.
Достоинством ПЦР является ее феноменальная чувствительность: теоретически она может быть возбуждена единственной копией ДНК-мишени. Но это и главный недостаток ПЦР как клинико-диагностического теста: он создает опасность ложноположительных результатов за счет минимальных загрязнений посторонними ДНК, особенно в лабораториях, регулярно выполняющих однотипные анализы. Впрочем, это чисто техническое возражение, которое при соблюдении надлежащего режима не может повлиять на диагностические возможности ПЦР. Более серьезные опасения возникли из-за ложнонегативных результатов, связанных с присутствием в исследуемом материале ингибиторов полимеразы. К счастью, с этим сталкиваются нечасто, но для надежности требуются специальные контроли.
Принцип специфической амплификации нуклеиновых кислот, заложенный в классическом варианте ПЦР, определил ряд новых направлений в диагностике инфекционных заболеваний. Отметим, например, выявление штаммов, резистентных к антибиотикам. Это достигается определением кодирующих генов, которые метят при помощи праймеров к участкам ДНК, отвечающим за данный признак. Для накопления вирусных РНК-генов ПЦР применяется после обратной транскрипции РНК в ДНК, что достигается при помощи ретровирусной транскриптазы. Широко используется лигазная цепная реакция (сшивание меченого и немеченого фрагментов гена под действием ДНК-лигазы), прямая репликация рибосомальных РНК (при помощи РНК-праймеров и РНК-полимеразы) и др. Словом, золотой эталон, которым считается выделение и идентификация чистой культуры возбудителей, выглядит уже не столь абсолютным на фоне некультуральных приемов, основанных прежде всего на выявлении генетических маркеров микроорганизмов.
Выявление иммунных сдвигов в организме хозяина
Присутствие микроорганизма создает конфликтную ситуацию, символом которой является иммунный ответ — образование антител и формирование клеточного иммунитета.
Антитела. Одним из универсальных признаков инфекции служат результаты серологического (иммунохимического) анализа, отражающего гуморальную реакцию хозяина на воздействие антигенов возбудителя. Серологический анализ означает исследование сыворотки крови (лат. serum — cыворотка), которая служит субстратом для накопления антител. Способы определения антител прошли ту же эволюцию, о которой говорилось выше в связи с иммунохимическими реакциями по выявлению антигенов. Первые методы, основанные на констатации внешних эффектов (агглютинация, преципитация, нейтрализация, связывание комплемента), почти целиком уступили место реакциям, где о положительном результате судят по связыванию меченых пероксидазой или щелочной фосфатазой антител против иммуноглобулинов человека (рис. 5).
К недостаткам серологического анализа относится ретроспективность, т.е. невозможность ранней диагностики острых инфекций. Это связано с тем, что для образования антител требуется время, которое составляет от двух недель до нескольких месяцев. Поэтому серологический метод позволяет судить о том, что данная инфекция произошла не сейчас, а в прошлом, и именно там надо искать источник и причину заражения.