Содержание
Таким образом, любой подход к регистрации апоптоза имеет свои преимущества и недостатки, поэтому всегда целесообразно начинать исследование с использования нескольких методов, определив корреляцию между ними, и впоследствии остановиться на наиболее удобном способе для решения конкретных задач.
Индукция апоптоза
По современным представлениям в каждой клетке имеются два основных механизма апоптоза: внешний (опосредованный через рецепторы смерти) и внутренний (митохондриальный, стресс-индуцированный). Большинство стрессирующих факторов (если они действуют в малых дозировках, не вызывая клеточного некроза) способны инициировать внутренний апоптоз. К ним относятся физические (радиация, ультрафиолетовое облучение, гипертермия) и химические (оксиданты, противоопухолевые препараты, токсины) стимулы, давно известные как цитотоксические агенты. Одним из универсальных индукторов апоптоза является окислительный стресс, который связан с реактогенными метаболитами кислорода, накапливающимися в клетках при различных воздействиях, особенно на фоне подавления антиоксидантных систем. Апоптоз служит стандартной реакцией на повреждение ДНК, и его индукция некоторыми агентами опосредована через этот канал.
В отличие от некроза апоптозный процесс развивается не только под влиянием формальных повреждений. Он возникает и как реакция на эндогенные факторы — гормоны, цитокины, дериваты арахидоновой кислоты, физические (прямые) межклеточные контакты. Общая формула такого «внешнего» апоптоза сводится к воздействию физиологических стимулов в нефизиологических концентрациях и сочетаниях. В подобных случаях апоптоз основан на рецепторном взаимодействии с индуцирующими агентами и зависит от типа клеток, их зрелости, физиологического состояния и природы стимулов. Удобной моделью для его изучения служат лимфоциты, которые подвергаются негативной селекции путем апоптоза, способны избегать апоптозной гибели, превращаясь в клетки памяти, а также индуцируют апоптоз в клетках-мишенях, добиваясь цитотоксического эффекта.
Имеются специальные рецепторы, сопряженные с активной смертью клеток. Важной является система Fas—FasL, где FasL cлужит лигандом, стимулирующим апоптоз после связывания с Fas (CD95), выступающим в роли рецептора. Fas имеется на многих клетках, тогда как FasL экспрессируется в основном активированными Т-лимфоцитами, являясь гомологом одного из важнейших цитокинов — туморонекротического фактора (ТНФ-a). Последний тоже относится к индукторам апоптоза и воспринимается рецепторами, по структуре напоминающими Fas. Цитоплазматический фрагмент Fas и ТНФ-рецепторов содержит домен смерти, транслирующий апоптозный сигнал (FasL, ТНФ-a) на внутриклеточный аппарат апоптоза. Этому механизму отводится важная роль в реализации гомеостатического и патогенетического потенциала цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, или Т-киллеров.
Экстраполируя наблюдения на мутантных мышах, допускают, что дефекты в системе Fas—FasL способствуют развитию лимфопролиферативных и аутоиммунных заболеваний, а гипертрофия Fas-зависимого апоптоза чревата деструктивными осложнениями, в частности избыточным уничтожением вирусинфицированных клеток. Кстати, клетки иммунологической памяти, видимо, лишены Fas и, возможно, поэтому избегают уничтожения.
Альтернативой можно считать пассивный (спонтанный) апоптоз, или апоптоз «по умолчанию» (англ. default). Он не является результатом стимуляции клеток, а возникает при недостатке тонизирующих сигналов — ростовых факторов и других активаторов, препятствующих реализации программы клеточного самоубийства. Это могут быть классические гормоны или факторы, действующие по паракринному или аутокринному типу.
Пассивный апоптоз характерен для клеток с высоким дифференцировочным и пролиферативным потенциалом, которые нуждаются в постоянной стимуляции, поддерживающей их жизнеспособность и самообновление. Подобные ситуации типичны для эмбриогенеза, но возникают и во взрослом организме. Так, недостаток тестостерона и адренокортикотропного гормона ведет к апоптозной инволюции простаты и коры надпочечников. В инвитровых культурах элиминация ростовых цитокинов (таких как интерлейкин-3, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин) вызывает апоптоз стволовых клеток гемопоэза. Отсутствие интерлейкина-2 индуцирует апоптоз Т-лимфоцитов. Эндотелиальные клетки, моноциты и эозинофилы погибают соответственно без фибробластного ростового фактора, ТНФ-a, интерлейкина-5. Из наблюдений за клеточными культурами известно, что выживание отдельных клеток во многом зависит от функциональных и физических контактов с соседними клетками. Каждая клетка в отдельности настроена на апоптоз, но реализация или подавление программы смерти решаются клеточной популяцией в целом, подобно тому как регулируется и поддерживается баланс в масштабе целого организма.
Регуляция апоптоза
Если исходить из концепции об апоптозе как о конкретной генетической программе, логичным выглядит представление о специализированных генах, продукты которых усиливают или подавляют апоптозный процесс. В апоптозе задействовано около сотни молекул. Они связаны между собой в каскадных и сетевых взаимодействиях, дублируют друг друга либо демонстрируют уникальность позитивных и негативных эффектов, участвуют в физиологических актах или работают преимущественно на апоптоз.
Ростстимулирующие факторы нацелены на пролиферацию, апоптозные сигналы ведут к отмиранию клеток. Равновесие между обновлением и апоптозом обеспечивает баланс в клеточной популяции, перекосы создают предпосылки для гиперплазии или атрофии тканей. Большинство фактов, подтверждающих правильность данного рассуждения, получено в изящных экспериментах на нематоде Caenorhabditis elegans. Этот червячок состоит из 1090 соматических клеток; 131 из них отмирает по ходу его умирания. Установлена группа ced-мутаций (от англ. cell death), которые блокируют гибель клеток, приговоренных к смерти. У мутантных форм C. elegans такие клетки не только сохраняются, но даже участвуют в жизнедеятельности организма. Идентифицировано более десятка генов, регулирующих отдельные этапы апоптоза — начиная с принятия решения о самоубийстве до фагоцитоза и разрушения апоптозных клеток. Два гена, ced-3 и ced-4, необходимы для индукции клеточной смерти и, по-видимому, экспрессируются в апоптозных клетках. Ген ced-9 действует в противоположном направлении, подавляя апоптоз. Его мутация ведет к общей гибели организма, доказывая, что все клетки способны к апоптозу, но в норме он генетически заблокирован. Ряд генов определяют распознавание и поглощение апоптозных клеток соседними клетками, хотя непосредственно не вовлечены в процесс отмирания. Наконец, ген нуклеазы (nuc-1) контролирует ДНК-азную активность и необходим для разрушения фагоцитированного материала.
Изучение апоптоза у высших животных в принципе подтвердило концепцию о его дуалистической (позитивной и негативной) регуляции. Примерами генов, продукты которых контролируют апоптоз клеток млекопитающих, являются bcl-2 (подавление), c-myc, p53 (усиление). Результат зависит от костимулирующих воздействий (например, от присутствия в среде цитокинов), типа клеток, структурных нюансов генных продуктов. Финал бывает неожиданным: вместо прогнозируемого апоптоза клетка вступает в митотический цикл, начиная пролиферативный процесс. Более того, некоторые из апоптозных генов относятся к группе протоонкогенов, т.е. генов, активирующих размножение клеток. Так, экспрессия c-myc в присутствии интерлейкина-3, эпидермального фактора роста или инсулиноподобного фактора-1 потенцирует пролиферацию клеток, тогда как без такого сопровождения активация с-myc запускает апоптоз. Повышение экспрессии нормального (дикого) р53 усиливает апоптоз, подавляя туморогенез; мутантный р53 лишается своей природной функции. До расшифровки этого факта р53 относили к онкогенам. Парадоксально, но решение идти по пути смерти или жизни часто принимается однотипными способами, и лишь совокупность определенных обстоятельств (определенных для клетки, но не ясных для наблюдателя!) влияет на окончательный результат.
Этот парадокс акцентирован в одной из крайних точек зрения: апоптоз является абортивным митозом, эволюция которого необратимо задерживается на одном из этапов — так называемых контрольных пунктах (англ. check points). Впрочем, такая диалектика сглаживается по мере углубления процесса, и с определенного этапа апоптоз располагает собственными эффекторами. Это соответствует тому, что постмитотические клетки, т.е. клетки, не способные к делению (например, нейтрофилы, нейроны, миоциты), сохраняют готовность к апоптозу.