Содержание
На модели Drosophila melanogaster предложена гипотеза о центральном генезе (англ. reapergene) апоптозного процесса, который, обобщая информацию, идущую из разных каналов, формирует апоптозную программу. При этом допускается, что клетки постоянно борются за выживание, продуцируя антиапоптозные белки-протекторы. Их недостаток ведет к гибели, т.е. жизнь и смерть клетки воспринимаются как соревнование между белками-эффекторами, обладающими противоположными функциями. Его исход зависит от количественных соотношений, активности и стабильности апоптозных и антиапоптозных факторов, которые неодинаково выражены у разных клеток и весьма динамичны.
В этой связи принципиален вопрос — связан ли апоптозный процесс с новообразованием белка? Первое впечатление о том, что от этого зависит индукция апоптоза, оказалось неточным или, по крайней мере, не универсальным — апоптоз удается не только возбудить, но и ускорить при подавлении белкового синтеза. Это соответствует наблюдениям, согласно которым апоптозные изменения могут сдерживаться за счет перманентной продукции короткоживущих ингибиторов. Торможение синтеза белка блокирует этот механизм, возбуждая процесс. С этой точки зрения, понятны данные о том, что цитопласты (клетки, лишенные ядра и других органелл), сохраняют способность к апоптозу, впрочем, как и изолированные ядра, помещенные в бесклеточную среду. На этом основании можно говорить о том, что часть эффекторов апоптоза конституциональны, не требуют индуцированного синтеза белка. Отсюда изменения ядерного материала, о которых говорилось выше, следует признать вторичными, не имеющими пускового значения в апоптозном процессе. Очевидно также, что несмотря на сходный морфологический сценарий существуют различные по механизму варианты апоптоза, причем некоторые из них эпигенетичны.
В целом представление о генах-убийцах, привлекающее мистикой и элегантной простотой, служит лишь базой для современных концепций апоптоза, логично вписываясь в общую канву физиологии и патологии клеток. Не исключено, что специализированных апоптозных генов у высших организмов вообще не существует. В таком случае это обычные гены, задействованные в других физиологических реакциях, а их летальный эффект является результатом суперэкспрессии или коэкспрессии с другими генами. Вместе с тем базисная программа активной смерти клеток остается достаточно консервативной, сохранив единые принципы (даже структурное сходство генов) на разных уровнях эволюции, начиная от червей и до человека. Это позволяет экстраполировать и обобщать результаты, получаемые на разных экспериментальных моделях.
Эффекторы апоптоза
Любое активное изменение клеточного фенотипа опосредовано действием медиаторов, переводящих клетку в новое качественное состояние. Это может быть следствием растормаживания заблокированных генов либо активации/подавления преформированных молекул-эффекторов.
В реализации апоптоза принимает участие множество молекул, которые вступают в сетевые взаимодействия, преломляя активность первичных сигналов. Мы уже говорили об усилении активности Са2+/Mg2+-зависимой эндонуклеазы, с которой связана фрагментация ядерного хроматина, хотя это скорее символ, чем основополагающий механизм апоптоза. Обнаружена активация другого фермента, Са2+-зависимой трансглутаминазы-II, которая вызывает перекрестные сшивки, ведущие к необратимым структурным изменениям, таким как образование ригидной оболочки вокруг апоптозных тел и обнажение необычных для нормальной клетки мембранных компонентов, распознаваемых макрофагами по типу лектин-, фосфатидилсеринзависимых и иных взаимодействий.
Обращает на себя внимание кратковременный подъем Са2+ и циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в клетках, вступивших на путь апоптоза. Искусственное снижение или повышение уровня внутриклеточного Са2+ соответственно подавляет или индуцирует апоптоз. Складывается впечатление об апоптозных сигналах, исходящих от субкомпонентов мембранных фосфолипидов, прежде всего церамида, который образуется при индуцированном гидролизе сфингомиелина или заново синтезируется при активации специфических ферментов (церамидсинтетазы).
Центральную позицию занимают высокорестриктированные эндопептидазы, именуемые каспазами (англ. caspase, от cystein-aspartate-proteinase, т.е. цистеиновые протеиназы, расщепляющие пептидную связь вслед за аспартатом). Из дюжины известных каспаз по крайней мере восемь имеют отношение к апоптозу. Номера каспаз не соответствуют их порядку в апоптозном каскаде, и принятое деление на «инициаторы» и «исполнители» (англ. executioners) довольно расплывчато. Каспазы предсуществуют в цитозоле в виде неактивных предшественников (прокаспаз), но, подвергаясь ограниченному протеолизу (предыдущая каспаза расщепляет последующую), обретают эффекторную (протеолитическую) активность. Этому способствует и формирование надмолекулярных комплексов (апоптосом), которые образуются при гетеродимеризации каспаз с апоптогенными внутриклеточными белками или при гибридизации самих каспаз. Установлено, например, что каспаза-9 активирует каспазу-3 после связывания с апоптогенными факторами митохондрий (цитохромом с и Apaf-1) и АТФ, а каспаза-8 образует активные тетрамеры, принимая апоптогенную эстафету от адаптерных белков, ассоциированных с «доменами смерти» (англ. DD, death domain) Fas и TNFR1 (рецептор типа 1 для альфа-туморонекротического фактора). Это ведет к активации нижележащих эффекторов, которые, атакуя клеточные субстраты, напрямую включаются в развитие апоптозного фенотипа.
Мишенями для каспаз служат многочисленные белки, в том числе ферменты и ингибиторы, задействованные в клеточном гомеостазе. В целом участие каспаз в апоптозе образно сравнивают с хорошо продуманной и организованной военной операцией. Они отрезают гибнущую клетку, разрушая межклеточные контакты и ее внутреннюю инфраструктуру (цитоскелет). Расщеплению подвергаются гелсолин, ряд киназ, играющих важную роль в поддержании целостности цитоскелета, а также сами элементы цитоскелета, в частности актин. Каспазы участвуют и в разрушении командного центра клетки — ядра: прекращаются репликация и репарация ДНК, начинается ее фрагментация. Расщепляются также структурные компоненты ядерной оболочки, что ведет к дезорганизации и конденсации хроматина. Результаты этой разрушительной деятельности вынуждают клетку выбрасывать «белые флаги» — различные маркеры апоптоза, после чего вся кампания завершается фагоцитозом погибшей клетки.
Наряду с каспазами заметная роль в апоптозных реакциях принадлежит семейству Вcl-2-протеинов (от англ. B-cell lymphoma/leukemia-2). В различных типах клеток идентифицировано около полутора десятка аналогов Bcl-2, которые объединены в отдельное семейство благодаря наличию гомологичных доменов. Члены этого семейства различаются направлением действия на апоптоз и поэтому разделены на подсемейства — анти- и проапоптозное. Накопились данные о том, что гомологи Bcl-2 опосредуют свой эффект через митохондрии. Это особенно важно для реализации внутреннего (спонтанного) пути апоптоза, который определяет гибель клеток без внешних воздействий. Как оказалось, митохондрии формируют своеобразный стыковочный узел апоптозного процесса, обеспечивая взаимодействие между каспазами и представителями семейства Bcl-2 протеинов.
Проапоптозные гомологи Bcl-2, такие как Bax (от англ. Вcl-2 associated protein x) и Bak (от англ. Bcl-2 homologous antagonist/killer), нарушают целостность митохондриальной мембраны, формируя в ней поры и вызывая возникновение так называемой митохондриальной дисфункции. Это выражается в падении трансмембранного потенциала внутренней митохондриальной мембраны и выходе в цитозоль проапоптозных составляющих митохондрий (в частности, цитохрома с и Apaf-1), что сопровождается активацией каспазного каскада. В известной мере толчком к этому служит передислокация Вах из цитозоля в митохондрии, предшествующая активации каспаз.
Антиапоптозные аналоги Всl-2 выполняют противоположные функции. Они поддерживают целостность митохондриальных мембран, предотвращая перераспределение проапоптозных вариантов молекул. Отсюда следует, что изменение соотношения про- и антиапоптозных гомологов Bcl-2 играет важную роль в реализации апоптозного фенотипа клеток.
Несмотря на очевидную важность митохондрий в апоптозной программе, эти органеллы не являются абсолютно необходимыми для апоптоза. Об этом говорят наблюдения над гибелью цитопластов, которые представляют собой пузырьки цитоплазмы, лишенные ядер, гранул и митохондрий. Они подвергаются изменениям, напоминающим апоптоз интактных клеток, подтверждая предположение о том, что в цитозоле клеток содержится адекватный механизм для поддержания их запрограммированной гибели. Причины безмитохондриального апоптоза в точности не известны. Безусловную роль играют колебания тирозинфосфорилирования в сигналпередающих каскадах. Антиапоптозное действие ряда факторов сочетается с усилением тирозинфосфорилирования белков, а естественные (интерлейкин-10) или искусственные (генестин) ингибиторы тирозинкиназ отменяют задержку индуцированного (внешнего пути) апоптоза.
Судьба апоптозных клеток
Эволюционируя, апоптоз завершается вторичным некрозом, который можно обнаружить по повышению проницаемости плазматической мембраны для постмортальных красителей (трипановый синий, йодид пропидиума и др.). В отличие от первичного некроза, когда повреждение мембраны служит пусковым фактором клеточной гибели, при апоптозе это знаменует окончание процесса. Впрочем, в естественных условиях дело обычно не доходит до вторичного некроза, так как апоптотирующие клетки уничтожаются профессиональными (макрофаги) и непрофессиональными (например, фибробласты) фагоцитами. Макрофаги, поглотившие апоптозные клетки, обнаруживаются в очагах воспаления, а также в культурах in vitro.