Содержание
Кроме антител при сифилисе формируется клеточный иммунитет, признаки которого выявляются у больных вторичным, латентным и третичным сифилисом в реакциях in vivo (кожные пробы) и in vitro (стимуляция Т-лимфоцитов трепонемными антигенами). Однако роль эффекторных Т-лимфоцитов, как и антител, при сифилисе не ясна. По крайней мере, в опытах на кроликах введение антител или сенсибилизированных лимфоцитов оказывает лишь частичный протективный эффект. Возможно, иммунитет зависит от совместного действия гуморальных и клеточных факторов. Следует помнить и о том, что при третичном сифилисе Т-лимфоциты включаются в развитие гуммозных поражений, т.е. играют патогенетическую, а не защитную роль.
В целом рассуждения об иммунитете при сифилисе затрагивают две проблемы. Содержание одной из них соответствует классической формуле инфекционной иммунологии — приобретению антигениндуцированной устойчивости к экзогенному реинфицированию. Для сифилиса это вероятно, но для реализации такой возможности необходим длительный контакт с возбудителем, чему препятствует раннее прерывание инфекции антибиотиками. Другой вопрос связан с сопротивлением эндогенной инфекции, которая при сифилисе надолго (нередко пожизненно) закрепляется в организме. Почти каноническое мнение о неэффективности иммунитета при сифилисе относится к неспособности хозяина уничтожить персистентную инфекцию, которая определяет эволюцию патологического процесса. Некоторые из причин ускользания трепонем от эффекторов иммунитета прокомментированы выше, но убедительных объяснений длительного сохранения T. pallidum в организме до сих пор не получено.
Лабораторная диагностика. При первичном и вторичном сифилисе T. pallidum можно обнаружить в очагах поражения. Используют микроскопию в темном поле, выявляя нативные (живые) трепонемы, или исследуют фиксированные препараты, применяя иммунофлюоресцентную микроскопию. В обоих случаях необходимо помнить о непатогенных трепонемах, которые входят в состав нормальной микрофлоры и могут присутствовать в исследуемом материале. В темном поле их отличают по морфологии, а при иммунофлюоресценции полагаются на антигенные различия с T.pallidum. При окраске по Граму T. pallidum не выявляются.
Но главным способом лабораторной диагностики сифилиса являются серологические тесты. В латентном периоде это единственная возможность выявления инфекции. Трудно назвать другое заболевание, при котором серологическая диагностика была бы столь разнообразной и имела бы такие же богатые традиции. В 1906 г. Вассерман, Нейссер и Брук предложили первый серологический тест для диагностики сифилиса, ставший классикой прикладной иммунологии. Не умея культивировать T. pallidum, авторы использовали в качестве антигена водный экстракт печени детей, погибших от врожденного сифилиса. Этот материал (инфицированная печень) содержал множество трепонем, и было логичным ожидать, что трепонемные антигены при экстракции перейдут в раствор.
Действительно, в смесях печеночного экстракта и сыворотки больных сифилисом происходило связывание комплемента, что, как известно, отражает образование комплексов «антиген—антитело». Именно такой вывод сделали Вассерман и его коллеги, а изобретенный ими метод (реакция Вассермана) тотчас получил широкое распространение как специфический тест на антитела против возбудителя сифилиса. Но дело оказалось сложнее. Выяснилось, что для получения «сифилисного антигена» вовсе необязательно экстрагировать материал от больных сифилисом: с равным успехом можно использовать печень и другие органы здоровых людей. Пришлось отказаться от ортодоксальной логики, заменив ее неожиданным для современников Вассермана парадоксом: у больных сифилисом появляются антитела против собственных антигенов хозяина! Сифилис — первая патология, при которой были обнаружены аутоантитела, т.е. вскрыт один из механизмов аутоиммунного ответа.
Активный фактор (антиген Вассермана) был идентифицирован в 1941 г. как один из фосфолипидов, входящих в состав митохондриальных мембран. Он известен под названием «кардиолипин», так как после многочисленных испытаний вассермановский реагент стали готовить из бычьего миокарда — ткани, богатой митохондриями. Кардиолипин широко распространен в живой природе, и в конце концов его удалось обнаружить у трепонем. Это побудило к очередному переосмысливанию феномена. Продукция «антител Вассермана» запускается кардиолипином трепонем, который в свободном состоянии лишен иммуногенности, но обретает ее в составе бактерий. Благодаря антигенной общности с тканевыми фосфолипидами такие антитела реагируют с тканевым (митохондриальным) кардиолипином. Этим, в частности, объясняется то, что эпитопный спектр истинных аутоантител против кардиолипина отличается от антикардиолипиновых антител при сифилисе. Такие антитела обнаруживаются при так называемом антифосфолипидном синдроме (например, при системной красной волчанке) и вызывают ложноположительные реакции Вассермана.
Несмотря на эти факты, антикардиолипиновые антитела традиционно называют неспецифическими, нетрепонемными, или (вовсе неудачно) — реагинами (не путать с реагинами немедленной аллергии!), а основанные на них серологические тесты классифицируют как неспецифические, нетрепонемные. Правильнее называть их кардиолипиновыми, помня о том, что они регистрируют антитела против неспецифических (нетрепонемных) фосфолипидов, имеющих общие эпитопы с кардиолипином трепонем. Антикардиолипиновые антитела не связываются с интактными трепонемами, так как фосфолипиды входят в состав плазматической мембраны, экранированной внешними структурами бактериальных клеток.
Вскоре после открытия комплементсвязывающего теста было установлено, что реакцию между вассермановским антигеном и сифилитическими сыворотками можно обнаружить по преципитации (флокуляции). Это послужило основой для разработки множества технических модификаций флокуляционного кардиолипинового теста на сифилис. Благодаря простоте, стандартности, дешевизне и скорости они вытеснили классическую реакцию Вассермана и широко используются для скрининга сифилисной инфекции. В микроварианте (реакция на предметном стекле с оценкой преципитации под микроскопом) результат учитывается через 2—3 мин (рис. 4). Россия — единственная страна, где инерция оказалась сильнее разумного прагматизма: реакция связывания комплемента (между кардиолипином и трепонемными антигенами) остается узаконенным методом лабораторной диагностики сифилиса.
Кардиолипиновые тесты имеют принципиальный недостаток: они не отличаются абсолютной специфичностью для сифилиса. Антитела к кардиолипину выявляются у 0,3—0,9% здоровых людей. Вероятность их обнаружения возрастает при острых инфекционных заболеваниях, но в этом случае они исчезают через несколько недель или месяцев после болезни (острые или транзиторные ложноположительные реакции). Хронические ложноположительные реакции (длительностью более 6 мес) наблюдаются у больных коллагенозами (системная красная волчанка, ревматоидный артрит), проказой, гемолитической анемией, а также у наркоманов и стариков. Полагают, что ложные антикардиолипиновые антитела образуются в ответ на фосфолипиды, высвобождающиеся из поврежденных тканей.
Стремление сделать диагностику более специфичной и учитывать антитела против самого возбудителя, а не только против «чужих» фосфолипидов привело к созданию альтернативного (точнее дополнительного) направления в серодиагностике сифилиса, основанного на выявлении антител против собственных антигенов T. pallidum. Они получили название трепонемных, или специфических тестов. Из-за невозможности культивировать in vitro трепонемы извлекают из тестикулярной ткани кроликов, зараженных штаммом Nichols.
Первой (1948 г.) была разработана реакция иммобилизации трепонем. К живым трепонемам добавляют исследуемую сыворотку и комплемент (сыворотка морской свинки); смесь инкубируют 18 ч при 37оС. В присутствии антител и комплемента трепонемы обездвиживаются и погибают. Метод высокоспецифичен и до сих пор служит эталоном для подтверждения позитивных кардиолипиновых тестов. Его недостаток — техническая сложность и дороговизна, так как живые трепонемы должны поддерживаться путем непрерывных пассажей на кроликах. Этого удается избежать в тестах, основанных на непрямой иммунофлюоресценции. В них используют убитые T. pallidum (штамм Nichols), фиксированные на предметном стекле. Если исследуемая сыворотка содержит специфические антитела, они фиксируются на трепонемах и могут быть обнаружены при помощи меченых антител против иммуноглобулинов человека. Это тоже очень чувствительный и специфичный тест, но и он слишком сложен для повседневной работы. Чаще его используют как референс-контроль для оценки новых методик.
Гораздо доступнее реакции, основанные на антигенах, извлеченных из T. pallidum. Их сорбируют на эритроцитах, выявляя антитела в реакции непрямой гемагглютинации, или фиксируют на полистероловых носителях для иммуноферментного анализа. В настоящее время благодаря генной инженерии появилась возможность клонирования трепонемных генов и получения на их основе рекомбинантных белков. Это открыло новые возможности для изучения иммунных реакций против дискретных антигенов T. pallidum.