Содержание
Открытый туберкулез легких — одна из немногих инфекций, при которых чрезвычайно полезна микроскопия материала, полученного от больного. Это классический образец экспресс-диагностики — микробиологического анализа без выделения чистой культуры. Здесь он строится на тинкториальном своеобразии возбудителя, а именно на его устойчивости к обесцвечиванию кислотами. Кроме окраски по Цилю—Нильсену, используют флюорохромные красители (аурамин, родамин), исследуя препараты под малым увеличением люминесцентного микроскопа. Это позволяет быстро просмотреть большое число полей зрения и тем самым повысить чувствительность метода.
И все-таки без дополнительных ухищрений разрешающая способность бактериоскопии довольно низка: в 1 мл должно быть не меньше 100000 микробных тел. Чтобы сделать метод более надежным, бактерии концентрируют, т.е. повышают их содержание в единице объема. Для этого мокроту, обработанную щелочью, подвергают центрифугированию или флотации (после добавления ксилола/бензола и тщательного встряхивания микобактерии, богатые липидами, всплывают вместе с пеной). Можно поступить проще, сделав толстый мазок путем последовательного наслоения-подсушивания нескольких капель мокроты. Используя эти приемы, положительный результат удается получить при содержании 5000—10000 бактерий в 1 мл мокроты. Это значительно ниже чувствительности культурального метода, но компенсируется быстротой, доступностью, а главное — эпидемиологической значимостью анализа. Дело в том, что положительный результат говорит о массивном выделении возбудителя, отражая опасность больного для окружающих. По этому признаку туберкулезных больных делят на бациллярных и абациллярных, подразумевая, что первые требуют особенно пристального внимания. Этиотропная терапия, снимающая бациллярность, делает больного практически незаразным.
Неоднократно делались попытки заменить или хотя бы усилить бактериоскопию другими методами экспресс-диагностики. С этой целью испытывались различные способы выявления антигенов и специфических метаболитов туберкулезной палочки. За немногими исключениями (например, определение туберкулостеариновой кислоты в спинномозговой жидкости и мокроте) они не принесли удовлетворения из-за плохой воспроизводимости или малой чувствительности. Одно из новейших направлений в диагностике туберкулеза основано на выявлении генетических маркеров (специфических последовательностей ДНК) М. tuberculosis в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Чувствительность современных вариантов ПЦР составляет 70—90% от культурального метода, дает положительный результат в 90—95% образцов мокроты от бациллярных больных и позволяет подтвердить диагноз у 50—60% абациллярных больных. Одна из технических трудностей ПЦР связана с ингибиторами ДНК-полимеразы, которые могут присутствовать в исследуемом материале.
Культуральные методы. Максимальной чувствительностью (если не считать заражения мокротой морских свинок — способ, который сегодня с диагностическими целями не используется) обладают культуральные методы, основанные на выделении и идентификации чистой культуры туберкулезной палочки. Они позволяют обнаружить 20—100 бактерий в 1 мл исследуемого материала. Для подавления сопутствующей микрофлоры мокроту деконтаминируют, пользуясь устойчивостью микобактерий к кислотам, щелочам и дезинфектантам. Обработанную пробу засевают на специальные питательные среды и инкубируют не менее 8 нед, наблюдая за динамикой роста. Культуры идентифицируют по характерным свойствам, спектр которых достаточно широк — от культуральных и морфотинкториальных признаков до профиля миколовых кислот и генетических маркеров. Неспособность к пигментообразованию и медленный рост позволяют отличить М. tuberculosis от большинства нетуберкулезных микобактерий. Позитивный ниациновый тест (в нем учитывается накопление в культуре ниацина, т.е. никотиновой кислоты) дифференцирует М. tuberculosis от М. bovis и беспигментных медленнорастущих микобактерий. Редкие ниациннегативные изоляты М. tuberculosis можно распознать по восстановлению нитратов.
Большинство штаммов М. tuberculosis вырастают в течение 4 нед, но возможна отсрочка (до 12 нед и более), особенно при исследовании материала от больных, леченных антитуберкулезными препаратами. Благодаря высокой чувствительности культуральные методы остаются золотым стандартом, т.е. точкой отсчета для суждения о разрешающей способности других методов. Но возможны и парадоксы, когда отрицательный анализ сочетается с позитивными результатами бактериоскопии мокроты, а тем более ПЦР. Это связано с гибелью микобактерий при деконтаминации или с утратой способности к размножению под влиянием антибиотиков. Первую причину удается сгладить, подняв специфичность деконтаминирующих процедур. Для этого пользуются мягким обеззараживанием мокроты или культивируют ее в присутствии антибиотиков, которые подавляют размножение других бактерий, не влияя на рост туберкулезной палочки.
Принципиальный недостаток культуральных методов — медленный рост микобактерий туберкулеза и отсюда запоздалые результаты. С этим предложено бороться при помощи остроумного метода микрокультур (метод Прайса). Его суть в том, что мазки, приготовленные и подсушенные на предметных стеклах (как для микроскопии), на несколько минут погружают в 5% раствор серной кислоты (деконтаминация) и после отмывания культивируют в жидкой питательной среде. Микроколонии, выявляемые при окраске по Цилю—Нильсену, достигают максимальных размеров через 7—10 дней, хотя нередко видны уже через 3—4 сут. Есть даже предложение (впрочем, спорное) судить по виду микрокультур о болезнетворности туберкулезной палочки: вирулентные штаммы, обладающие корд-фактором, образуют змеевидные микроколонии типа жгутов/кос (см. рис. 3), авирулентные — растут в виде аморфных скоплений. Метод Прайса и его модификации не стали стандартной процедурой, так как лишены точности классического культурального анализа.
Предлагались и более изощренные способы ускоренной идентификации растущих культур, основанные, например, на измерении радиоактивного углекислого газа (14СО2), который высвобождается микобактериями туберкулеза из меченой пальмитиновой кислоты. Внедрение подобных методов в широкую практику остается проблематичным, так как сопряжено с немалыми техническими трудностями и расходами.
Иммунологическая диагностика
В 1906 г. Пирке, опираясь на наблюдения повышенной реактивности к туберкулезной палочке зараженного организма, предложил использовать кожные тесты с туберкулином для диагностики туберкулеза, точнее, туберкулезной инфекции. Для характеристики чувствительности к туберкулину Пирке ввел понятие об аллергии и ее полярном варианте — анергии. Из многочисленных модификаций «старого туберкулина Коха» закрепился препарат «очищенных белковых дериватов» — ППД (англ. PPD — purified protein derivatives). Это комплекс освобожденных от питательной среды бактериальных белков, которые в сумме представляют собой «аллерген туберкулезной палочки» — действующее начало туберкулина. Это означает, что туберкулин — не мономолекулярный субстат, а смесь микробных антигенов, которые после достаточно жесткой (денатурирующей) обработки сохраняют способность выявлять ГЗТ к микобактериям туберкулеза.
Проба Пирке предусматривала введение препарата через скарифицированную кожу. Позже (в 1910 г.) для повышения точности метода туберкулин стали вводить внутрикожно (проба Манту). Препарат дозируют в туберкулиновых единицах (ТЕ). В одной ТЕ ППД содержится 0,00006 мг сухой массы туберкулина. Обычная дозировка составляет 2 ТЕ. Ее вводят в объеме 0,1 мл в ладонную поверхность предплечья, результат учитывают по диаметру инфильтрата через 72 ч. Отсчет ведется c 5 мм, папулы меньшего размера (2—4 мм) считают сомнительными. Различают слабую (5—9 мм), среднюю (10—14 мм) и выраженную (15—16 мм) аллергию. Начиная с 17 мм у детей и подростков и с 21 мм у взрослых, реакции расценивают как гиперергические. При появлении везикулы, лимфангиита или регионарного лимфаденита реакции считают гиперергическими независимо от размера инфильтрата. Гиперемию любого размера без инфильтрата воспринимают как сомнительный результат, справедливо полагая, что в таких случаях не задействованы главные эффекторы ГЗТ — сенсибилизированные Т-лимфоциты и макрофаги.
Гиперчувствительность к туберкулину возникает через 3—8 нед после заражения и сохраняется многие годы, исчезая лишь после элиминации туберкулезной палочки из организма (например, после длительной антибиотикотерапии). Это означает, что по туберкулиновым пробам можно судить о зараженности микобактериями туберкулеза, картируя зоны эндемичности туберкулезной инфекции. Труднее дифференцировать активные и излеченные формы болезни. Наиболее надежны реакции высокой интенсивности, усиление туберкулиновых проб (на 6 мм и более) или переход от отрицательной к положительной реакции (вираж туберкулиновой пробы). Это отражает активацию эндогенной инфекции или реинфицирование извне. Лица с гиперергическими реакциями чаще страдают туберкулезом, а у детей повышение чувствительности к туберкулину нередко предшествует заболеванию. Вообще, туберкулиновые пробы наиболее надежны именно в детском возрасте, когда вероятность неактивных очагов достаточно мала.