Содержание
Заражение микобактериями бычьего типа происходит при употреблении молока больных коров, и ветеринарный контроль за животными в сочетании с пастеризацией молока практически исключают опасность для человека. Эти простые мероприятия, ставшие очевидными после признания М. bovis самостоятельным видом микобактерий, привели к резкому сокращению «коровьего» туберкулеза, став одним из блестящих достижений чисто санитарной эпидемиологии. Полной ликвидации М.bovis мешает его циркуляция среди многочисленных видов диких животных.
Родовое название Mycobacterium (грибовидные бактерии) предложено Леманом и Нойманом в 1896 г., обративших внимание на плесневидную пленку, которая образуется при росте туберкулезной палочки на поверхности жидких сред (аэробы!). Вскоре коллекция микобактерий была дополнена видами, изолированными из внешней среды. Оказалось, что именно свободно живущие сапрофиты составляют большинство этой своеобразной группы прокариот, а истинно паразитические микобактерии представлены всего несколькими видами, патогенными для человека и животных. Впрочем, известную опасность представляют и некоторые микобактерии-сапрофиты (рис. 1). Они вызывают оппортунистические инфекции (микобактериозы) у иммунокомпрометированных лиц, а при заражении в раннем детстве могут извращать реактивность организма к возбудителям туберкулеза.
Известно более 60 видов микобактерий. Они объединены в род Mycobacterium семейства Mycobacteriaceae, которое относится к порядку Actinomycetales. В этом есть логика. Подобно актиномицетам, микобактерии образуют ветвящиеся клетки (особенно in vitro). Но сходство имеет и более глубокие корни, по крайней мере с соседями по порядку — нокардиями и коринебактериями. И те и другие содержат липиды, которые напоминают миколовые кислоты, хотя и уступают микобактериям по сложности строения этих уникальных компонентов клеточной стенки.
Морфология, тинкториальные свойства
Микобактерии туберкулеза представляют собой тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки, длиной 1—4 мкм и около 0,3 мкм в ширину (рис. 2). Они неподвижны, не образуют спор и капсулы, если не считать микозидной оболочки, которую иногда сравнивают с микрокапсулой. Они плохо окрашиваются по Граму, но, восприняв окраску, не обесцвечиваются этанолом, поэтому их считают грамположительными, хотя правильнее не относить ни к тем, ни к другим. С трудностями окраски туберкулезной палочки впервые столкнулся Кох, сумевший разглядеть их в мазках из мокроты лишь после 24—30-часовой (!) инкубации в щелочном растворе метиленовой синьки.
Избирательная окраска основана на так называемой кислотоустойчивости микобактерий и включает два основных этапа. Сначала повышают проницаемость клеточной стенки для насыщенного раствора красителя (расплавление восковидного слоя путем прогревания или протравливания детергенами), а затем окрашенный препарат промывают разведенными кислотами. Обесцвечивая большинство бактерий, это сохраняет окраску микобактериальных клеток. По классической методике Циля—Нильсена на фиксированный мазок наливают карболовый фуксин, нагревают до отхождения паров, промывают закисленным этанолом (3% НСl в 85% растворе этанола) и докрашивают метиленовой синькой. Микобактерии удерживают фуксин и выглядят как красные палочки на голубом фоне; остальные бактерии теряют фуксин и окрашиваются в синий цвет. Этанол здесь не обязателен, но делает фон более чистым. Устойчивость к обесцвечиванию (она связана с образованием прочных комплексов между красителем и миколовыми кислотами клеточной стенки) проявляется не только в отношении кислот, но также щелочей и спиртов. Поэтому с равной справедливостью микобактерии можно называть также щелоче- и спиртоустойчивыми.
Морфологические и тинкториальные признаки микобактерий имеют много исключений, породивших немало споров о природе возбудителя. Туберкулезная палочка может терять кислотоустойчивость и хорошо окрашиваться по Граму, превращаться в филаментозные и даже мицелиоподобные формы, распадающиеся на палочки и кокки (гранулы/зерна Муха). Некоторые из них настолько малы, что проходят через бактериальные фильтры (фильтрующиеся формы). Теперь ясно: речь идет о фенотипической изменчивости, которая отражает экологическую пластичность возбудителя и его способность выживать в неблагоприятных условиях. Отсюда не удивительно, что плеоморфизм туберкулезной палочки сильнее проявляется в инвитровых культурах, т.е. в неестественной среде обитания.
Культуральные особенности
Туберкулезные микобактерии — строгие аэробы и мезофилы, т.е. растут в диапазоне 30—42° С, лучше всего при 37°С. Размножение происходит очень медленно: период генерации составляет 14—16 ч (типичные бактерии делятся каждые 15 мин). Поэтому для получения обильного роста требуется не менее 4—6 нед, хотя миниатюрные колонии могут появиться через 7—10 дней. Туберкулезная палочка принадлежит к числу наиболее вяло реплицирующихся микобактерий. Большинство сапрофитических видов размножаются быстрее, их рост заметно отстает от других прокариот и хорошо заметен не ранее чем через 5—7 дней. Одной из причин отсроченного размножения микобактерий является высокая гидрофобность, связанная с обилием липидов в клеточной стенке. Это затрудняет поступление в бактерии питательных веществ, снижая их метаболическую активность.
Выделение первичных культур (т.е. непосредственно от больного) проводят на специальных средах, самые сложные из которых содержат яйца, картофельную муку и глицерин. Для подавления сопутствующей микрофлоры добавляют малахитовый зеленый или генцианвиолет. При субкультивировании туберкулезная палочка становится менее прихотливой и растет на обычных средах с добавкой глицерина.
В жидких средах рост происходит на поверхности (аэроб!). Нежная сухая пленка со временем утолщается, становится бугристо-морщинистой и обретает желтоватый оттенок, часто сравниваемый с цветом слоновой кости. Бульон остается прозрачным и добиться диффузного роста удается только в присутствии детергентов, например твина-80. В микроколониях (они образуются на ранних сроках и заметны только под микроскопом) формируются структуры, напоминающие жгуты — признак, который связывают с так называемым корд-фактором М. tuberculosis (рис. 3).
Внутривидовые варианты
Морфотинкториальная изменчивость, о которой говорилось выше, весьма характерна для туберкулезной палочки, но это — фенотипические варианты, которые не переходят в генетически закрепленные биовары. Попытки выявить устойчивые серотипы М. tuberculosis и М. bovis не увенчались успехом, прежде всего из-за спонтанной агглютинации клеток, которая является следствием их высокой гидрофобности (см. ниже). Более удачным оказался опыт фаготипирования, но и он не закрепился в лабораторной практике.
В современных исследованиях много внимания уделяется дифференцировке (клонированию) микобактериальных штаммов по генетическим маркерам, прежде всего по особенностям хромосомного профиля ДНК. Генотипирование обычно проводится на основе вставочных генов — инсерционных последовательностей (англ. insertion sequences — IS). Они отличаются структурным полиморфизмом, позволяя классифицировать штаммы по степени генетического родства. Чаще используется анализ последовательности IS6110. Применяются и другие, дополнительные методы, основанные на особенностях генетического аппарата М. tuberculosis. К их числу относится сполиготипирование (от англ. spacer oligotyping), сравнение по числу прямых повторов и полиморфной G-С-обогащенной повторяющейся последовательности.
Полная идентичность возможна лишь внутри одного клона бактерий. Отсюда сравнение с отпечатками пальцев — англ. DNA fingerprinting. Каждое очередное поколение (т.е. каждый новый клон) несет хотя бы небольшие генетические различия. Накапливаясь со временем, они ведут к формированию клоногрупп, объединяемых в семейства. Тенденцию к распространению имеют клональные кластеры, еще не достигшие статуса группы. Наиболее изученным и распространенным (в том числе в России) является W-Beijing-семейство штаммов микобактерий туберкулеза. Оно включает более десятка клоногрупп — генетических ответвлений, эволюционировавших по IS6110 в различных географических зонах. Факторы, содействующие селекции штаммов W-Beijing, не известны. Возможно, это связано с повышенной контагиозностью, устойчивостью во внешней среде, резистентностью к антибиотикам. Именно первый W-штамм (акроним выбран произвольно), изолированный в 1990 г. в США, открыл тревожную эру лекарственной полирезистентности микобактерий туберкулеза. Есть мнение, что W-Beijing-штаммы более удачливы в преодолении барьера, создаваемого BCG-вакцинацией. Впрочем, каждая из перечисленных позиций встречает возражения.
Большую озабоченность вызывает эволюция лекарственной устойчивости на основе генетически закрепленных мутаций М. tuberculosis. Распространение резистентных биоваров может обезоружить в борьбе с туберкулезом или, по крайней мере, заметно снизить ее эффективность. Не случайно в системе лабораторий США, работающих с возбудителями особо опасных инфекций, организован центр, единственная задача которого — изучение штаммов туберкулезной палочки с множественной устойчивостью к антибиотикам.
Клеточная стенка
Разгадка своеобразия микобактерий связана с необычностью их поверхностных структур. В клеточной стенке, устроенной сложнее, чем у других бактерий, преобладают липиды (более 60% сухой массы), в том числе специфичные для микобактерий. Именно они определяют нестандартность тинкториальных, физиологических и экологических свойств туберкулезной палочки (см. таблицу). Разнообразие микобактериальных липидов, в которых с трудом ориентируются даже искушенные биохимики, заставляет пользоваться такими собирательными понятиями, как миколовые кислоты, микозиды, сульфолипиды, корд-факторы и пр.
| Признак | Причина |
| Тинкториальные свойства: | |
| неокрашиваемость обычными способами | Слабая проницаемость клеточной стенки |
| кислото-, щелоче-, спиртоустойчивость | Связывание красителей миколовыми кислотами |
| Медленное размножение | Низкая скорость внутриклеточной диффузии питательных веществ |
| Культуральные свойства (сухие, морщинистые колонии), спонтанная агглютинация бактериальных клеток | Гидрофобность клеток |
| Устойчивость во внешней среде | Защита от высыхания |
| Устойчивость к дезинфектантам | Медленное проникновение антисептиков в клетку |
| Взаимоотношения с макрофагами: | |
| поглощение | Гидрофобность клеток |
| внутриклеточное выживание | Блокада образования фаголизосом, нейтрализация антимикробных факторов, ускользание в цитоплазму (повреждение фагосомальных мембран) |
| Цитотоксичность | Повреждение митохондриальной мембраны |
| Особенности иммунитета, иммунопатогенез | Иммуноадъювантная активность, CD1-зависимое представление антигенов (гликолипидов) |
Большинство липидов представлено миколовыми кислотами и их производными — длинноцепочечными (60—90 углеродных атомов), разветвленными жирными кислотами. Нечто подобное есть только у коринебактерий и нокардий, но корино- и нокардиомиколовые кислоты гораздо короче — соответственно 28—40 и 40—60 углеродных атомов. Часть миколовых кислот ковалентно связана с пептидогликаном посредством арабиногалактана. При экстракции хлороформом его получают в виде фракции «воск D». Миколовые кислоты образуют подобие палисада, определяя восковидность структуры. Но миколовые кислоты не только фиксированы в каркасе клеточной стенки. Они присутствуют и в виде свободных гликолипидов-сульфолипидов (сульфатидов) и корд-фактора (точнее корд-факторов), едва ли не самого знаменитого из микобактериальных липидов. Это трегалоза (дисахарид глюкозы), эстерифицированная двумя молекулами миколовых кислот (димиколат трегалозы). По укоренившемуся представлению, корд-фактор определяет рост М. tuberculosis в виде серпантинных жгутов (англ. cord — жгут, веревка; см. рис. 3). Этому есть экспериментальные подтверждения, хотя непонятно, почему такие микроколонии не образуют другие микобактерии, содержащие сходные факторы. Из учебника в учебник переписывается положение о том, что корд-фактор — чуть ли не главный фактор вирулентности туберкулезной палочки. Однако для этого нет достаточных оснований. В клеточных культурах корд-фактор токсичен для биологических (особенно митохондриальных) мембран, но это зависит от вспомогательных факторов, которых могут быть лишены невирулентные штаммы М. tuberculosis и непатогенные микобактерии. На эту роль претендуют, в частности, сульфатиды (трегалоза, эстерифицированная сульфатной группой и четырьмя миколовыми кислотами), образующие мембранотропные цитотоксические комплексы с корд-фактором. Впрочем, туберкулезная палочка не утрачивает вирулентности и при почти полном отсутствии сульфатидов. Такого рода противоречия побуждают искать более сложные механизмы болезнетворности — прямые и опосредованные.