Была визуализирована структура альфа-актинина в опухолевых клетках HeLa Kyoto-TagRFP-actinin в контрольном образце (без добавления препарата) и в опытных образцах (с добавлением исследуемых препаратов в полулетальных концентрациях). Оценка ультраструктурных изменений цитоскелета проводилась в двух временных точках — через 1–3 и 18–24 ч инкубации клеток с препаратом.
При инкубации с таксолом наблюдался цитостатический эффект, а именно образование реорганизованных скоплений микрофиламентов. В случае с цисплатином характер исчерченности и упорядоченности актинового цитоскелета менялся в сторону хаотичности.
В случае с ясплакинолидом наблюдалось образование большего количество сшивок альфа-актинина, так как данный препарат стимулирует полимеризацию актиновых филаментов. После воздействия цитохалазина Д происходила быстрая агрегация концов микрофиламентов, а также блокировалось формирование различных выступов клетки, таких как филоподии.
Выводы. С помощью высокоразрешающей локализационной микроскопии с применением флуоресцентного белка TagRFP визуализирована структура альфа-актинина в опухолевых клетках HeLa Kyoto и проанализированы ее ультратонкие изменения при воздействии противоопухолевых препаратов — таксол и цисплатин, и экспериментальных химических агентов — ясплакинолид и цитохалазин Д.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 14-25-00129.
Н.П. Павлова1,2, М.М. Карабут2, В.В. Елагин2, М.А. Сироткина2, Л.А. Матвеев2,3, А.В. Шумилова1,2
Применение метода мультимодальной ОКТ для оценки эффективности лучевой терапии химически индуцированной опухоли
Руководитель работы Н.Д. Гладкова, заместитель директора по науке НИИ БМТ, д.м.н., профессор
1ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»;
2НИИ Биомедицинских технологий, Нижегородская государственная медицинская академия;
3ФГБУН Институт прикладной физики РАН, г. Нижний Новгород
Оптические методы диагностики состояния тканей могут обнаруживать биохимические и морфологические изменения, связанные с ответом опухоли на лечение. Так, оценка первичного ответа на лечение позволила бы повысить его эффективность. Одним из оптических методов, который может быть применен для решения подобных задач, является мультимодальная оптическая когерентная томография (ММ ОКТ), прижизненный неинвазивный метод диагностики.
Цель работы — оценить возможности метода ММ ОКТ в оценке эффективности лучевой терапии (ЛТ) химически индуцированной опухоли защечного мешка хомяка.
Материалы и методы. Эксперименты проводились на самках золотых сирийских хомяков. Химическое индуцирование опухоли осуществляли путем нанесения 0,5% раствора 9,10-диметил-1,2-бензантроцена в минеральном масле на левый защечный мешок хомяка 3 раза в неделю в течение 12 недель.
Исследования выполнены на ММ ОКТ-устройстве с использованием спектрального принципа приема сигнала, разработанном в ИПФ РАН (г. Нижний Новгород). ММ ОКТ включает два вида визуализации: кросс-поляризационную ОКТ (КП ОКТ), которая регистрирует кросс-рассеяние и двулучепреломление, и микроангиографическую ОКТ (МА ОКТ), которая демонстрирует картину микроциркуляторного русла.
Радиационное облучение осуществляли на аппарате гамма-облучения фракционно по 7 Гр в неделю до достижения суммарной дозы 21 Гр. Состояние ткани оценивали через 24 ч после каждого облучения, а при достижении дозы 21 Гр — еженедельно. Материал для гистологического анализа забирали через 48, 72 ч и на 8, 14, 28-е и 35-е сутки после окончания лечения. Для верификации состояния ткани проводилось параллельное сопоставление ОКТ-изображений с гистологическими препаратами. По данным КП ОКТ-изображений рассчитывался интегральный фактор деполяризации (ИФД), безразмерный параметр, характеризующий способность биоткани изменять поляризацию отраженного или рассеянного назад излучения, с использованием программы MatLab.
Результаты исследования. Показано, что КП ОКТ-изображения опухоли характеризуются бесструктурностью и неравномерным уровнем сигнала, а также его быстрым спаданием по глубине до уровня фона. Их визуальная оценка затруднена, что не дает возможность проанализировать процессы, происходящие в опухоли. Известно, что радиационное облучение, воздействуя на ткани, меняет их поляризационные свойства. В связи с этим предпринималась попытка количественной оценки поляризационных характеристик по В-сканам путем расчета ИФД. Выявлено, что критерием эффективности ЛТ может служить уменьшение численного значения ИФД — по изменению ОКТ-сигнала опухоли можно оценить степень ее повреждения и установить, насколько облучение было эффективно.
По данным ОКТ МА-изображений опухоль до ЛТ богата сосудами, которые к 8-м суткам после облучения тромбируются, что приводит к полному исчезновению сосудов на изображении вплоть до 21-х суток.
При гистологическом анализе обнаружено, что нарастание изменений вследствие облучения в наиболее значительной мере происходит в кровеносных сосудах и соединительной ткани, в то время как клеточный компонент опухоли практически не реагирует. К тотальному коагуляционному некрозу опухоли приводит не прямая гибель клеток, а гибель клеток вследствие расстройства кровообращения. Все выявленные методом ММ ОКТ изменения опухоли подтверждены гистологическими данными.
Заключение. Метод ММ ОКТ прижизненно и объективно отражает процессы, происходящие в опухоли в ответ на лучевую терапию, поэтому in vivo мониторинг эффекта ЛТ с помощью ММ ОКТ может быть крайне полезен для прогнозирования ответа ткани на облучение. Вычисление ИФД дает информацию об изменениях в ткани в ходе ЛТ, что может быть использовано для оценки эффекта терапии в реальном времени.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Правительства РФ № 14.В25.31.0015 и РФФИ грант №16-34-00995.
Л.Е. Шимолина1,2, М.К. Куимова3
Исследование вязкости опухолевых клеток с помощью молекулярного ротора BODIPY-C10 in vivo
Руководитель работы М.В. Ширманова, к.б.н., заведующая лабораторией индивидуальной химиотерапии рака НИИ БМТ НижГМА
1Нижегородская государственная медицинская академия;
2Нижегородский национальный исследовательский государственный университет им. Н.И.Лобачевского;
3Имперский колледж Лондона, Великобритания
Вязкость является важнейшим параметром биологических систем, поскольку ее изменение может быть связано с серьезными нарушениями морфологического или физиологического состояния клетки. Измерение локальной вязкости в клетках в реальном времени стало возможно благодаря развитию методов флуоресцентного биоимиджинга и появлению флуоресцентных молекулярных роторов. Также актуален вопрос о поиске эффективных биосовместимых солюбилизаторов для гидрофобных молекулярных роторов.
Цель работы — исследование фармакокинетики и биораспределения флуоресцентного молекулярного ротора BODIPY-C10, солюбилизированного полимерными щетками, в организме лабораторных животных, а также исследование времени жизни флуоресценции ротора в экспериментальной опухоли методом FLIM (Fluorescence Life-time Imaging Microscopy).
Материалы и методы. Исследование было выполнено на мышах линии Balb/с с подкожно привитой опухолью CT26. Молекулярный ротор BODIPY-C10 в виде водного раствора вводили животным внутривенно в дозе 5 мг/кг. Количественное определение ротора в плазме крови осуществляли методом спектрофлуориметрии, забирая кровь из ретроорбитального синуса через 0,1, 1, 2, 4, 6 ч после введения препарата. Флуоресцентные изображения животных получали на установке IVIS-Spectrum (Caliper Life Sciences, США). Флуоресценцию ротора возбуждали на длине волны 500 нм, сигнал принимали на 540 нм, экспозиция 2 с. Изображения получали до внутривенного введения ротора, через 10 мин, 1, 2, 5, 24, 48, 144 ч после инъекции. Для двухфотонной флуоресцентной микроскопии и FLIM использовали многофотонный томограф MPTflex (JenLab, Германия). Флуоресценцию возбуждали фемтосекундным лазером на длине волны 800 нм при мощности лазера 12 мВт и регистрировали в диапазоне 409–680 нм. Проводили мониторинг определенного участка в течение 2,5 ч, регистрируя многофотонные и FLIM-изображения каждые 15 мин после введения ротора, через 5 и 24 ч.