Д.М. Кузьмина1, И.И. Белоусова2
Динамика МК-801 зависимого поведения мышей после длительной блокады NMDA-рецепторов
Руководитель работы И.В. Мухина, профессор, д.м.н.
1ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»; 2Нижегородская государственная медицинская академия
Шизофрения — распространенное эндогенное заболевание, представляющее собой медико-биологическую проблему, поиск путей решения которой не приостанавливается в течение многих десятилетий. Поскольку глутаматергическая гипотеза развития шизофрении с 1980 г. является одной из наиболее распространенных в нейронауке, значительная часть методик моделирования шизофрении направлена на блокаду NMDA-рецепторов конкурентными и неконкурентными антагонистами. Несмотря на большой экспериментальный материал, неясными остаются адаптационные механизмы, направленные на поддержание гомеостаза нейронных сетей и изменение поведения после длительной блокады NMDA-рецепторов.
Цель исследования — изучение отдаленных последствий длительной блокады NMDA-рецепторов в отношении комплекса поведенческих реакций мышей, отражающих фенотип поведения при моделировании шизофрении в эксперименте.
Материал и методы: 30 мышей линии С57BL/6j, самцов, возраст 8 недель, неконкурентный антагонист NMDA-рецепторов — (-/-)МК-801. Использовались следующие поведенческие методики: исследование пространственной рабочей памяти (радиальный лабиринт), социальное поведение (тест Кроули), двигательной активности (Аktimeter), рабочей памяти в челночной камере (Shuttle box).
Результаты исследования. Рабочая память является частью долговременной и включает в себя кратковременную память, т.е. только ту информацию из долговременной памяти, которая находится в активной обработке. При исследовании изменений пространственной рабочей памяти в радиальном лабиринте на фоне введения препарата МК-801 было выявлено постепенное ухудшение пространственного ориентирования животного, обусловленного нарушенной работой нейронных сетей гиппокампа. Сниженная пространственная рабочая память сохранялась и в течение последующих после отмены блокатора NMDA-рецепторов 10 дней.
Социальная активность животных после 10-дневного введения МК-801 достоверно не отличалась в экспериментальной и контрольной группах, однако отмечалось увеличение вариабельности показателей социального поведения после введения МК-801.
При исследовании удаленных эффектов МК-801 на ориентировочно-исследовательскую рефлекторную активность было обнаружено достоверное различие числа вертикальных стоек у экспериментальной и контрольных групп.
Изучение рабочей памяти при формировании условного рефлекса пассивного избегания в отдаленном периоде после блокады NMDA-рецепторов не выявило различий между экспериментальной и контрольными группами, что говорит о восстановлении структуры нейронных сетей в области фронтальной коры, ответственных за хранение и извлечение долговременной памяти при формировании условного рефлекса в челночной камере.
Таким образом, курсовое введение блокатора глутаматных NMDA-рецепторов вызывает стойкое изменение поведения животных, выявленное при поведенческом фенотипировании долговременной памяти, социального и двигательного поведения. Это может быть использовано при скрининге новых психотропных препаратов, направленных на лечение психических заболеваний, в том числе шизофрении.
Выводы. МК-801 вызывает ухудшение пространственной рабочей памяти, но не рабочей памяти, исследуемой в челночной камере при формировании условного рефлекса пассивного избегания в отдаленный период после отмены блокады NMDA-рецепторов, что свидетельствует о более глубоком нарушении структуры нейронных сетей в области гиппокампа, чем фронтальной коры. Социальная активность животных через 10 дней после 10-дневного курса введения МК-801 изменяется недостоверно, однако прослеживается недостаток общительности, обнаружены резкие колебания показателей социального поведения экспериментальных животных, что свидетельствует о сохранности изменения социального поведения в отдаленном периоде после отмены блокады NMDA-рецепторов. Вертикальная двигательная активность животных, отражающая ориентировочно-исследовательский рефлекс, не восстанавливалась через 10 дней после 10-дневного курса введения МК-801.
С.А. Родимова1, 2, В.В. Дуденкова1, 2, А.В. Мелешина1, 2, Д.С. Кузнецова1, 2
Исследование состояния свободной и связанной форм НАДН мезенхимальных стромальных клеток в процессе остеогенной дифференцировки на скаффолдах методом FLIM
Руководитель работы Е.В. Загайнова, д.м.н., профессор
1 НИИ Биомедицинских технологий, НижГМА, ННГУ им. Н.И. Лобачевского;
2 ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
Одно из актуальных направлений современной науки — исследование метаболического статуса стволовых клеток (СК) при направленных дифференцировках. К важнейшим регуляторам дифференцировки и самообновления СК относятся энергетический обмен и окислительно-восстановительный статус в клетках. Более того, значительную роль играет клеточное микроокружение и их ниша. Стандартная модель для изучения клеточного метаболизма представляет собой клеточный монослой, который не может достаточно полно отражать поведение и свойства клеток, существующих в норме в трехмерных условиях. В качестве модели, имитирующей клеточную нишу, могли бы выступить трехмерные каркасы-скаффолды, которые в настоящее время активно исследуются в тканевой инженерии с целью устранения костных дефектов.
Большинство современных методов исследования метаболизма СК базируется на введении экзогенных меток, что представляет собой довольно травматичный процесс, который, к тому же, не дает полной информации о пролиферации и дифференцировке СК. Новой технологией для изучения клеточного метаболизма является неинвазивный, высокоспецифичный метод мультифотонной микроскопии с детекцией времени жизни флуоресценции FLIM (fluorescence lifetime imaging). Одним из самых чувствительных и информативных внутренних биомаркеров для изучения метаболизма в живых клетках служит НАДН+Н+.
Цель — изучение состояния свободной и связанной форм НАДН-мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в процессе остеогенной дифференцировки на 3D-скаффолдах методом FLIM.
Материалы и методы. Изучалась культура мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга кролика, выделенных по стандартной методике. В качестве трехмерных матриц использовали полилактидные скаффолды, полученные методом двухфотонной фотополимеризации. В ранних исследованиях показана их превосходная биосовместимость. Клетки высевали на скаффолды в количестве 50 000 на один образец, помещали готовые скаффолды с ММСК в два типа культуральных сред: стандартную (MesenCult™ Proliferation Kit) и остеогенную (MesenCult™ Osteogenic Stimulatory Kit) и культивировали в условиях CO2-инкубатора. Время жизни флуоресценции детектировали с помощью микроскопа LSM 710 (Carl Zeiss, Germany), оборудованного FLIM-системой (Simple-Tau 152, Becker&HicklGmbH, Germany), в течение 3 недель культивирования.
Результаты. Были проанализированы времена жизни флуоресценции и их вклады материала скаффолда без клеток, скаффолда с клетками и клеток в монослое (контроль). Для этого в программе SPCImage (Becker&Hickl) проводился анализ:
- τ1 (время жизни флуоресценции короткой компоненты, что соответствует свободной форме НАДН);
- τ2 (время жизни флуоресценции длинной компоненты, что соответствует связанной форме НАДН);
- a1 (вклад короткой компоненты во время жизни флуоресценции);
- a2 (вклад длинной компоненты во время жизни флуоресценции).
Показано, что в клеточном монослое времена жизни свободной и связанной форм НАДН, а также вклад связанной формы НАДН увеличивались в дифференцированных клетках, однако различия были статистически не значимы. В 3D-скаффолдах не обнаружено изменений времен жизни флуоресценции клеток и их вкладов в процессе остеогенной дифференцировки, статистически значимых различий не выявлено. Материал скаффолдов, полученных методом двухфотонной полимеризации, вносил вклад в общее время жизни флуоресценции, что не позволило зафиксировать изменение времен жизни флуоресценции клеток, адгезированных к скаффолдам, во время дифференцировки.