Б.А. Артыкходжаева, М.С. Ташмухамедов, Ш.У. Турдикулова
Получение молекулы PET45B-ЛДГ-II для получения рекомбинантной формы фермента лактатдегидрогеназы
Ташкентский химико-технологический институт, Узбекистан
Лактатдегидрогеназа используется в наборах для биохимического анализа крови. Фермент является основным компонентом набора по определению аланинаминотрансферазы.
Цель работы — клонирование гена лактатдегидрогеназы и получение рекомбинантной молекулы ДНК — pET45b-ЛДГ-II.
Материалы и методы. Суммарную РНК выделили из мышечной ткани сердца быка Bos taurus с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия). Затем выделенный ген переводили в к-ДНК форму с помощью фермента обратной транскриптазы. Полученную суммарную к-ДНК использовали для амплификации гена ЛДГ-II. Амплификацию гена ЛДГ-II выполняли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработку олигонуклеотидных праймеров для амплификации гена проводили с помощью программы OLIGO (версия 3.3) с учетом данных о первичной структуре гена LDH Bos taurus. В качестве матрицы для амплификации кодирующей области гена LDH из Bos taurus использовали последовательность данного гена из баз данных GenBank (BC151427. 1). Праймеры содержали на 5’-концах дополнительные последовательности, включающие сайты рестрикции SalI для прямого праймера и NotI для обратного, и были предназначены для амплификации и последующей встройки структурной области гена в полилинкер экспрессирующего вектора pET-45b по соответствующим сайтам. Обратный праймер был сконструирован таким образом, чтобы полученный ампликон не содержал стоп-кодон и обеспечивалась состыковка рамок считывания гена и последовательности His6. Амплифицированный ген обработали эндонуклеазами рестрикции SalI и NotI для получения липких концов. Для клонирования был выбран экспрессионный вектор pET-45b, предназначенный для экспрессии рекомбинантных белков в E. coli и содержащий ген резистентности к ампициллину.
После гидролиза эндонуклеазами рестрикции у вектора появились липкие концы, комплементарные концам амплифицированного гена ЛДГ. Выделенные продукты гидролиза рестриктазами векторной ДНК и ампликона гена ЛДГ лигировали ДНК-лигазой фага Т4. В результате была получена векторная конструкция, содержащая вставку копии гена лактатдегидрогеназы pET-45b-ЛДГ. Затем векторная конструкция трансформирована в клетки E. coli для клонирования — ТОР10 (Invitrogen). В результате трансформации и селекции на ампициллине получили колонии на агаре, которые были перенесены в 3 мл жидкой среды и культивировались 16 ч. Далее проводилось выделение плазмидной ДНК и контрольная рестрикция.
Результаты исследования. Впервые клонирован ген лактатдегидрогеназы В из сердца быка в векторные системы. Для этого осуществлен дизайн и синтез праймеров, подобраны условия амплификации, необходимые для клонирования, из суммы к-ДНК гена лактатдегидрогеназы. Была получена рекомбинантная молекула ДНК — pET45b-LDHB.
Заключение. Разработка методов генетической инженерии, позволяющих клонировать в составе молекулярных векторов отдельные гены любых организмов и вводить их в гетерологичное окружение клетки-реципиента, открыла перспективы для решения такого фундаментального вопроса биологии, как экспрессия эукариотических генов в бактериальных и дрожжевых клетках. Методами генетической инженерии созданы штаммы бактерий, дрожжей, линии клеток, с высокой эффективностью продуцирующих биологически активные белки человека и животных. Это позволяет получать эукариотические полипептиды в огромных по сравнению с недавним прошлым количествах, что упрощает процедуру их очистки вплоть до индивидуального состояния.
Получение рекомбинантной формы ЛДГ дает возможность использовать ее для производства отечественных наборов для биохимического анализа АЛТ.
С.С. Бачурин, Т.В. Карпенко, М.О. Кубанова, Д.И. Новикова, С.А. Мзикян, И.А. Арапов
Возможности судебно-медицинской экспертизы в оценке пятен крови, обнаруженных на месте происшествия (случай из практики)
Руководитель работы Д.П. Березовский, к.м.н., доцент, заведующий кафедрой судебной медицины
Ростовский государственный медицинский университет
Оценка пятен крови при осмотре места происшествия имеет огромное значение в установлении истины по делу, при восстановлении обстоятельств совершенного преступления. Большое внимание уделяется морфологии пятен крови и их локализации.
Одним из важных принципов оценки доказательств, в том числе биологического происхождения, является комплексный подход. В качестве примера мы приводим случай из собственной экспертной практики с использованием экспертного эксперимента.
02.10.20XX в садоводческом товарище «САДОВОД-ЛЮБИТЕЛЬ» был обнаружен труп мужчины Т., 1972 г.р. По данным судебно-медицинского исследования, причиной смерти явилась открытая проникающая черепно-мозговая травма (ОПЧМТ) с множественными многооскольчатыми симметричными переломами костей свода черепа и линейным переломом костей основания черепа. По полученным объективным данным можно было утверждать, что смерть потерпевшего наступила в пределах 10 мин после причинения ОПЧМТ.
07.10.20XX следователем СУ СК на данной территории был проведен дополнительный осмотр автомобиля, принадлежавшего предполагаемому обвиняемому. На дне багажника легкового автомобиля, под резиновым ковриком было обнаружено «пятно жидкой крови». Молекулярно-генетическая экспертиза установила, что обнаруженная кровь принадлежит потерпевшему. В ходе судебного разбирательства у суда возникло обоснованное сомнение в том, что данное пятно крови могло образоваться непосредственно после убийства потерпевшего 02.10.20ХХ. Для разрешения этого казуса в рамках дополнительной экспертизы мы провели экспертный эксперимент.
Научная гипотеза: в указанных выше условиях пятно крови таких размеров не могло оставаться жидким в течение 5 дней с учетом данных Гидрометцентра на конкретной территории.
Цель исследования — смоделировать указанные выше условия и проследить изменения, происходящие с пятном крови в течение пяти суток.
Материалы и методы. В багажник автомобиля, покрытие которого изготовлено из синтетического волокна (карпет), помещен автомобильный резиновый коврик. Под коврик в 5 точках (по 4 углам, на расстоянии 10 см от края и точно по середине) нанесли количество крови, достаточное для формирования пятна 18 см2. Затем пятна были аккуратно накрыты резиновым ковриком. С учетом данных судебно-медицинской экспертизы трупа, объективно подтверждающей, что смерть потерпевшего была без выраженного агонального периода, в образцы крови добавлен этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА-Na). Автомобиль был оставлен на улице на 5 суток. Благодаря портативной метеостанции и сводке о погодных условиях в районе СТ «САДОВОД-ЛЮБИТЕЛЬ» на 02.10.20XX, эксперимент удалось смоделировать в пределах ошибки эксперимента. Время проведения было выбрано таким образом, чтобы погодные условия по основным параметрам (температура, атмосферное давление, влажность) соответствовали исходным.
Результаты. На 5-е сутки было обнаружено, что все пять (!!!) экспериментальных пятен крови оказались абсолютно сухими. На поверхности карпета и резинового коврика в местах соприкосновения с кровью видны следы крови с неровными краями. Из полученных пятен крови без особых технических сложностей оказалось возможным отобрать образцы для генетического типирования.
Выводы. Для полноценной научно-обоснованной судебно-медицинской оценки следов крови требуется тщательный осмотр места происшествия с фиксацией в протоколе осмотра не только размеров и локализации пятен крови, но и ряда физических (природных) параметров. Наличие этих сведений позволит избежать ошибочной интерпретации результатов.