Оценка активности каспазы-3 с помощью FRET-сенсоров может найти применение в медицине как способ ранней детекции запуска апоптоза в опухолевых клетках и стать одним из показателей эффективности лечения.
Цель работы — оценка возможности регистрации FRET-сигнала сенсора активности каспазы-3 в экспериментальной опухоли животных методом флуоресцентного биоимиджинга.
Материалы и методы. Для исследования был использован FRET-сенсор на основе mKate2 (дальнекрасный GFP-подобный флуоресцентный белок в качестве донора) и iRFP (инфракрасный флуоресцентный белок в качестве акцептора). Объектом исследования выступали самцы и самки мышей Balb/c массой 18–20 г. Были сформированы следующие группы животных:
- с опухолью CT26 с сенсором mKate2—DEVD—iRFP;
- с опухолью CT26 с флуоресцентным белком mKate2;
- контрольная группа — опухоль CT26 без сенсора.
Для получения опухолевой модели в область бедра животным осуществлялась подкожная или внутримышечная инъекция 500 тыс., 1 млн. и 2 млн. опухолевых клеток, растворенных в 100 мкл PBS. Открытие опухоли осуществляли под наркозом (золетил-рометар, 60 мкл внутримышечно). Для подбора оптимальных длин волн возбуждения и эмиссии FRET-сенсора методом поверхностного флуоресцентного имиджинга использовалась установка IVISSpectrum (Caliper Life Sciences, США). Анализ сигнала флуоресценции проводили в программе LivingImage.
Результаты исследования. Было установлено, что для mKate2 (донор) наибольшая интенсивность флуоресценции наблюдалась при длинах волн возбуждения и эмиссии 570 и 640 нм соответственно; для iRFP (акцептор) флуоресценцию возбуждали на длине волны 570 нм, принимали на длине волны 720 нм; во FRET-паре возбуждение донора и эмиссия акцептора были отмечены при длинах волн 570 и 720 нм соответственно. На подобранных настройках осуществляли контроль флуоресценции опухолей в процессе роста методом поверхностного флуоресцентного имиджинга.
Было выявлено отсутствие флуоресценции в опухоли СТ26 без сенсора (контрольная группа) при разных длинах волн возбуждения и эмиссии. В отличие от контрольной группы у животных с опухолями СТ26 с сенсором mKate2—DEVD—iRFP интенсивность флуоресценции изменялась в разные дни роста опухоли.
С целью сравнить интенсивность флуоресценции FRET-сенсора (mKate2-DEVD-iRFP) были выполнены измерения на животных с опухолью, закрытой кожей, и опухолью с открытой кожей. С помощью программы EMBL ImageJ оценивали отношение интенсивности флуоресценции донора к флуоресценции FRET-пары. Установлено, что интенсивность флуоресценции в опухоли неравномерная, что указывает на неоднородность опухолевой ткани. Сравнение отношения интенсивности флуоресценции донора к флуоресценции FRET-пары в опухоли, закрытой кожей, и в опухоли с открытой кожей показало, что они соответствуют друг другу. Это указывает на возможность регистрации флуоресцентного сигнала в опухоли, закрытой кожей.
Заключение. Была разработана методика детекции FRET-сигнала по соотношению дальнекрасной и инфракрасной флуоресценции каспазного сенсора mKate2—DEVD—iRFP в опухолях животных на основе флуоресцентного молекулярного имиджинга.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект №14-25-00129).
В.В. Бережной
Биологические свойства эфирных масел, выделенных из растений семейства Artemisia
Руководитель работы С.Б. Ахметова, зав. кафедрой микробиологии, к.м.н., доцент
Карагандинский государственный медицинский университет, Казахстан
Поиск биологической активности среди эфирных масел флоры Казахстана обоснован неугасающим интересом к этой группе источников природных фитонцидов. Объектом исследований стали эфирные масла — Artemisia kazakorum, Artemisia latifolia, Artemisia hipoliti. Растения произрастают на территории Казахстана, образцы масел наработаны в АО «МНПХ Фитохимия» (г. Караганда) и предоставлены профессором Г.А. Атажановой. Эти образцы проявляют умеренно-выраженную активность в отношении грамположительных штаммов (S. aureus, B. subtilis).
Цель исследования — изучение противогрибковой активности эфирных масел с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК).
Материал и методы. Антифунгальную активность исследовали в соответствии с методикой изучения спектра антифунгального действия противогрибковых препаратов методом серийных разведений с определением МПК. Препараты сравнения: эфирное масло эвкалипта, нитрофунгин, контроль ДМСО.
Результаты исследования. Противогрибковую активность показали эфирное масло Artemisia kazakorum, Artemisia latifolia, Artemisia hipoliti. МПК составила 0,16–0,64 мг/мл, эфирное масло Artemisia kazakorum в концентрации 2,5 мг/мл действовало на T. rubrum, 2,0 мг/мл — на T. mentagrophytes var. gypseum; 2,0 мг/мл — M. canis, для C. аlbicans фунгицидный титр составил 2,0 мг/мл. Эфирное масло Artemisia latifolia проявило фунгицидные свойства в отношении T. rubrum — в концентрации 3,0 мг/мл, для M. canis и C. аlbicans —2,0 мг/мл.
Выводы. Представленные эфирные масла —Artemisia kazakorum, Artemisia latifolia, Artemisia hipoliti — рекомендованы к дальнейшему доклиническому изучению для создания перспективных лекарственных противогрибковых препаратов.
О.Е. Фурман1, Н.В. Клементьева2, А.С. Мишин3
Исследование ультраструктуры цитоскелета опухолевых клеток при воздействии противоопухолевых препаратов методом высокоразрешающей микроскопии
Руководитель работы Е.B. Загайнова, д.м.н., директор НИИ БМТ НижГМА
1Нижегородский национальный исследовательский государственный университет им. Н.И. Лобачевского;
2Нижегородская государственная медицинская академия;
3Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Важным звеном при лечении злокачественных образований является создание противоопухолевых агентов, целенаправленно воздействующих на мишени, определяющие фенотип клетки. Такой мишенью может стать цитоскелет, а именно актин и актин-связывающие белки. В связи с тем, что актиновый цитоскелет представляет собой обширную сеть тончайших микрофламентов и подвержен динамическим перестройкам, необходимы высокоточные методы его визуализации. Поэтому актуальной задачей становится эффективное приложение методов высокоразрешающей микроскопии к исследованию ультраструктуры цитоскелета опухолевых клеток, подвергшихся воздействию химиопрепаратов.
Цель работы — анализ ультраструктуры актинового цитоскелета опухолевых клеток под воздействием различных противоопухолевых препаратов и экспериментальных химических агентов методом высокоразрешающей микроскопии.
Материалы и методы. В работе использовались химиотерапевтические препараты цисплатин (Тева, 0,5 мг/мл) и таксол (Bristol-Myers Squibb, 6 мг/мл), а также экспериментальные химические агенты ясплакинолид (Enzo Life Sciences, 1 мM) и цитохалазин Д (Enzo Life Sciences, 25 мг/мл).
Эксперименты проводились на клеточной линии HeLa Kyoto (рак шейки матки человека). Моделью исследований выступал актин-связывающий белок альфа-актинин, меченный красным флуоресцентным белком TagRFP. Применялись следующие методы: ведение культур эукариотических клеток, временная трансфекция клеток, МТТ-тест, флуоресцентная локализационная микроскопия единичных молекул, обработка данных с помощью программного обеспечения ImageJ и μManager.
Результаты. На первом этапе работы с помощью МТТ-теста были установлены полулетальные концентрации цисплатина (7 мкмоль/л), таксола (0,078 мкг/мл), ясплакинолида (0,2 мкмоль/л) и цитохалазина Д (7,75 мкг/мл) для клеток HeLaKyoto. Затем была получена линия клеток HeLaKyoto, временно экспрессирующая флуоресцентный белок TagRFP, слитый с альфа-актинином. Ранее нами было показано, что флуоресцентный белок TagRFP способен спонтанно переходить из темнового во флуоресцентное состояние при облучении 561 нм лазером низкой мощности. Для осуществления локализационной микроскопии единичных молекул на основе TagRFP мы получали серии последовательных изображений флуоресцирующих клеток, в среднем по 3000–5000 кадров. Впоследствии были реконструированы изображения данных клеток со сверхвысоким разрешением.