Выводы. Показана возможность изучения состояния свободной и связанной форм НАДН ММСК в процессе остеогенной дифференцировки методом FLIM на скаффолдах, однако данный тип матриц не может быть использован в качестве трехмерной подложки-носителя. Материал исследуемых скаффолдов имеет такие же времена жизни флуоресценции, как и клетки, адгезированные к скаффолдам.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект №14-15-00536).
А.С. Быстрова1, В.В. Дуденкова1, 2, Е.В. Загайнова2
Исследование внутриклеточного рН и вязкости в недифференцированных костно-мозговых мезенхимных стволовых клетках человека
Руководитель работы А.В. Мелешина, к.б.н.
1 Нижегородский государственный университет им. Лобачевского;
2 НИИ Биомедицинских технологий, НижГМА, ННГУ им. Н.И. Лобачевского
Идентификация и исследование структурно-функциональных свойств линий стволовых клеток человека и животных являются важнейшими задачами современной клеточной биологии и биоинженерии. Важными параметрами внутриклеточной физиологии, требующих активного изучения, являются метаболическая активность живых клеток, которая анализируется с помощью внутренних биомаркеров НАД (Ф)Н и флавинов, организация ультраструктуры цитоскелета, рН, вязкость и др. Уже были получены результаты об изменении метаболической активности мезенхимных стволовых клеток в процессе дифференцировки, однако важно изучить и другие параметры — уровень показателя рН и вязкости.
Цель — определить уровень рН и вязкости в недифференцированных костно-мозговых мезенхимных стволовых клетках человека.
Материалы и методы. Объектом исследования служила первичная культура костно-мозговых мезенхимных стволовых клеток (МСК) человека.
Для оценки уровня внутриклеточного рН был использован стандартный флуоресцентный рН-зонд BCECF. В предварительных экспериментах проведена калибровка с флуоресцентным красителем BCECF (использовались калибровочные растворы со значениями рН 6,8; 7,0; 7,2; 7,4; 7,6; 7,8; 8,0) для перевода условных единиц рН в абсолютные единицы. Для оценки уровня внутриклеточного рН МСК инкубировали с флуоресцентным красителем BCECF. Визуализация проводилась с использованием конфокального флуоресцентного микроскопа LSM710 (Carl Zeiss, Германия). Полученные изображения обрабатывали с помощью программы Image J (NIH, США).
Вязкость цитоплазматической мембраны определяли с использованием молекулярного ротора группы BODIPY. Флуоресцентные и FLIM изображения получали на микроскопе LSM710 (Carl Zeiss, Германия) с FLIM системы (Becker&Hickle GmbH). Полученные FLIM изображения обрабатывали с помощью программы SPCImage (Becker&Hickl GmbH, Германия). Изменения вязкости цитоплазматической мембраны клеток анализировали по изменению времени жизни молекулярного ротора.
Результаты исследования. Средний уровень внутриклеточного рН составило 7,6, в соответствии с калибровкой. Полученный результат согласуется с имеющимися литературными данными. Внутриклеточный рН стволовых клеток является более щелочным по сравнению с рН нормальных дифференцированных клеток и сходен с рН опухолевых клеток. Среднее значение вязкости цитоплазматической мембраны было равно 364,06±20 сПз. На сегодняшний день еще не проводилось измерений микровязкости в стволовых клетках с использованием роторов BODIPY.
Заключение. Были определены и проанализированы уровни внутриклеточного рН и вязкости в недифференцированных МСК человека. В дальнейшем планируется исследовать изменение внутриклеточного рН и вязкости в процессе дифференцировки МСК в трех направлениях: адипогенном, остеогенном и хондрогенном.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект №14-15-00536).
К.А. Астафьева, Е.С. Пугина, А.И. Самойлова, С.В. Трофимова
Оценка цитотоксического действия физических факторов излучения газоразрядной плазмы в экспериментах in vitro
Руководитель работы И.П. Иванова, д.б.н., зав. лабораторией физико-химических исследований
Нижегородская государственная медицинская академия; Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
В настоящее время проблемой практической онкологии является высокая токсичность и низкая избирательность действия противоопухолевых препаратов. Ведется поиск и разработка новых эффективных технологий с цитотоксическим действием в отношении неопластических клеток. Особый интерес представляет такой физический фактор, как излучение газоразрядной плазмы (Иванова И.П., 2006, 2014). Установлено его бактерицидное, спороцидное и цитотоксическое действие, в том числе в отношении опухолевых клеток (Иванова И.П., Трофимова С.В., 2005, 2009, 2012, 2014). Однако до настоящего времени не изучен вклад физических факторов газоразрядной плазмы в цитотоксическое действие.
Цель работы — оценка вклада физических факторов излучения газоразрядной плазмы в цитотоксический эффект в экспериментах in vitro.
Материалы и методы. В работе использовали генераторы излучения плазмы с различными характеристиками: частотой 1, 10, 50 и 100 Гц; потоком фотонов 1,26×10-10 и 5,4×10-8 моль(см2с)-1; энергией 0,05 и 5 Дж/имп. Объекты исследования: взвеси эритроцитов интактных животных и животных с лимфосаркомой Плисса ((4,8–5)×107 кл/мл); суспензии клеток лимфосаркомы Плисса (ЛСП) и рака молочной железы (РМК) (5×106 кл/мл). Суспензии клеток объемом 4 мл обрабатывали в различных временных режимах, от 30 до 3600 с. Контролем служили необработанные образцы.
Количество нежизнеспособных клеток после обработки оценивали с помощью трипанового синего (Герасимов И.Г., 2007). Гидрофобность и микровязкость мембран опухолевых клеток изучали по флуоресценции 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена и пирена (Иванова И.П., Трофимова С.В., 2014). Изменение метаболической активности опухолевых клеток исследовали по флуоресценции НАДН и ФАД+ (Иванова И.П., Трофимова С.В., 2014).
Результаты исследования. Установлено, что наиболее выраженным цитотоксическим действием в отношении эритроцитов обладают устройства с частотой 1 и 10 Гц, энергией 0,05 Дж и потоком фотонов (5,4×10)-8 моль (см2с)-1. Выявлена большая устойчивость мембран у животных с неопластическим процессом по сравнению с интактными животными. Количество жизнеспособных клеток лимфосаркомы Плисса после воздействия излучением плазмы с различными характеристиками постепенно уменьшалось с увеличением времени воздействия до 3600 с, однако 100% цитотоксического действия достигнуто не было вне зависимости от частоты, энергии в импульсе и плотности потока фотонов.
Оценка состояния мембран клеток ЛСП и РМК после воздействия излучением плазмы с различной частотой и потоком фотонов показала, что изменения гидрофобности носили разнонаправленный характер. Наиболее выраженные изменения зарегистрированы при воздействии наибольшим потоком фотонов — снижение в 5 раз. К более значительному снижению микровязкости мембран опухолевых клеток приводит излучение плазмы с низкими частотами 1 и 10 Гц и наибольшим потоком фотонов (5,4×10)-8 моль(см2с)-1. Показано, что к наибольшему накоплению восстановленного НАД·Н приводит воздействие наибольшим потоком фотонов в 5 раз по сравнению с контрольной группой. Уровень окисленного ФАД возрастал при действии частотами 1 и 10 Гц в пять и два раза соответственно, а при воздействии потоком фотонов (1,26×10)-10 моль(см2с)-1 — в два раза.
Заключение. Цитотоксический эффект излучения газоразрядной плазмы находится в прямой зависимости от плотности потока фотонов и в обратной — от частоты и энергии в импульсе. Наиболее выраженные изменения гидрофобности и микровязкости мембран клеток и их метаболический активности вызывает излучение газоразрядной плазмы с потоком фотонов (5,4×10)-10 моль(см2с)-1 и частотами 1 и 10 Гц.
А.А. Чичагова1, И.Н. Дружкова2, В.В. Дуденкова1,2, Н.И. Игнатова2, М.М. Лукина1,2, М.В. Ширманова1,2
Определение внутриклеточного водородного показателя опухолевых клеток при химиотерапевтическом воздействии
Руководитель работы Е.В. Загайнова, д.м.н., директор НИИ БМТ НижГМА