1Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; 2Нижегородская медицинская академия
Онкологические заболевания как причина смертности населения занимают второе место после заболеваний сердечно сосудистой системы. В настоящее время на территории России одобрены к применению в клинике более 100 противоопухолевых препаратов. Однако их эффективность ограничена. Серьезную проблему для лекарственной терапии злокачественных новообразований представляет множественная лекарственная устойчивость (МЛУ).
Среди причин формирования МЛУ в литературе активно обсуждается роль водородного показателя опухоли. Известно, что внутриклеточный рН опухолевых клеток является более щелочным, по сравнению с нормальными клетками организма (7,12–7,65 при норме 6,99–7,2), а внеклеточный рН опухоли — более кислым (6,2–6,9 при норме 7,3–7,4). Таким образом, на мембране опухолевых клеток формируется обратный градиент pH, обеспечивающий увеличение пролиферативной активности, уклонение от апоптоза и невосприимчивость к лекарственным препаратам.
В ряде исследований показано, что в результате химиотерапевтического воздействия наблюдается закисление цитоплазмы опухолевых клеток. Однако ранний ответ на химиотерапевтическое воздействие не был широко изучен и представляет интерес как с теоретической, так и с практической точек зрения.
Самыми распространенными в клинической практике являются химиопрепараты, оказывающие неспецифическое цитостатическое и цитотоксическое воздействие.
Цель исследования — изучение изменения внутриклеточного водородного показателя при воздействии химиотерапевтических препаратов на примере клеток опухоли аденокарциномы шейки матки человека.
Материалы и методы. В исследовании использована клеточная линия рака шейки матки человека HelaKyoto, трансфецированная геном желтого флуоресцентного белка-сенсора SypHer2. Данный флуоресцентный сенсор имеет два пика возбуждения флуоресценции (420 и 500 нм) и пик эмиссии на 516 нм. Химиотерапевтическое воздействие оказывали препаратами таксол (цитостатическое действие) и цисплатин (цитотоксическое действие). Лекарственную чувствительности клеток оценивали с помощью колориметрического теста для оценки метаболической активности клеток (МТТ-тест). Визуализацию флуоресцентного генетически кодируемого сенсора производили с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM-710 (Carl Zeiss, Germany).
Результаты исследования. На первом этапе работы были установлены полулетальные дозы препаратов и проведена калибровка сигнала сенсора SypHer2 с использованием серии буферных растворов.
Было установлено, что динамика внутриклеточного рН при добавлении препаратов таксол и цисплатин отличается. Через 40 мин после добавления таксола внутриклеточный рН изменяется в щелочную сторону, с 7,28±0,10 до 7,53±0,13, затем постепенно снижается до 7,15±0,13 через 24 ч после добавления препарата.
При добавлении цисплатина в течение 3 ч наблюдается снижение внутриклеточного рН (минимальное значение 7,16±0,05), затем увеличение до 7,4±0,07 к 4 ч после добавления препарата. Через 24 ч внутриклеточный рН снижается до 7,16±0,14.
Статистическую обработку данных проводили минимум по 50 клеткам для каждой исследуемой точки.
Заключение. Определено изменение внутриклеточного водородного показателя опухолевых клеток рака шейки матки человека при воздействии химиотерапевтическими препаратами разного механизма действия. При раннем ответе опухолевых клеток на химиотерапию наблюдается защелачивание цитоплазмы, при этом динамика развития данной реакции отличается для двух препаратов. Полученные данные представляют интерес для понимания механизма действия препаратов и повышения их эффективности.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 14-25-00129.
Д.А. Логинова, А.Д. Крайнов, П.Д. Агрба, М.Ю. Кириллин
Моделирование спектральных характеристик биоткани мозга лабораторной мыши
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород
Цель работы: моделирование спектральных характеристик биоткани мозга лабораторной мыши в видимом и ближнем ИК-диапазонах оптическими фантомами, состоящими из модельных сред: липофундина МСТ/ЛСТ 20%, поглотителей с различными спектральными зависимостями.
Материалы и методы. Спектральные характеристики биоткани мозга лабораторной мыши измерялись на образце, полученном ex vivo и предварительно гомогенизированном. Восстановленные оптические свойства, находящиеся в соответствии с данными литературы, использовались в качестве базовых при разработке фантомов.
Оптический фантом представляет собой водный раствор липофундина МСТ/ЛСТ 20%, тушей красной, черной, синей и цвета фуксии, спектральные характеристики которых были предварительно измерены и сопоставлены со спектрами образца биоткани.
Спектральные характеристики, такие как коллимированное и диффузное пропускание, диффузное отражение, были оценены методом спектрофотометрии с помощью спектрофотометра Analytikjena Specord 250 plus с применением интегрирующей сферы. Восстановление оптических свойств — коэффициентов поглощения и рассеяния — производилось в соответствии с методикой, основанной на приближении малократного рассеяния и модифицированном законе Бугера-Ламберта-Бера.
Результаты исследования. Спектр поглощения мозга мыши имеет характерные особенности, обусловленные спектром поглощения гемоглобина. Вид спектральной зависимости определяется соотношением концентрации оксигенированного гемоглобина HbO2, имеющего два характерных пика поглощения с максимумами на длинах волн 542 и 576 нм, и деоксигенированного гемоглобина Hb, которому свойственен один максимум на длине волны 556 нм.
Спектры поглощения красной туши и цвета фуксии имеют два резких пика в зелено-желтой области спектра: 520 и 560 нм для красной, 535 и 565 нм для туши цвета фуксии. В красном и ближнем ИК-диапазонах поглощение незначительно. Для синей туши пик поглощения отмечается около 600 нм, а также на длине волны 700 нм. Данные особенности позволяют наиболее точно смоделировать спектральные характеристики гемоглобина.
На базе спектров поглощения и рассеяния образца биоткани и модельных сред было подобрано соотношение концентраций компонентов фантома, которое обеспечивает оптические свойства, близкие к значениям характеристик мозга лабораторной мыши. Разработанный фантом представляет собой оптически стабильную среду. Образец фантома хранился при температуре +4Сº. Сравнение оптических свойств фантома сразу после приготовления и через неделю показало, что отклонение значений не превышает 5%.
Заключение. В результате был разработан фантом, моделирующий оптические свойства биоткани мозга лабораторной мыши в диапазоне 400–1100 нм. Расхождение в оптических свойствах фантома и биоткани мозга не превышает в среднем 20%. Имитация фантомом свойств биоткани в видимом и ближнем ИК-диапазонах позволяет использовать его в установках оптической диффузионной томографии с целью их калибровки и проведения опорных измерений, а также для апробации методов и сравнения эффективности различных систем.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проекты 15-32-20227 и 15-02-04270).
Г.С. Перельман1, О.А. Злобовская2, В.В. Дуденкова1,3, М.В. Ширманова1
Исследование апоптоза в экспериментальных опухолях животных с помощью генетически кодируемого FRET-сенсора активности каспазы-3
Руководитель работы Т.Ф. Сергеева, к.б.н., научный сотрудник
1Нижегородский национальный исследовательский университет им. Н.И. Лобачевского;
2Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН, Москва;
3Нижегородская государственная медицинская академия
Апоптоз представляет собой регулируемый процесс программируемой клеточной гибели. Одним из основных ферментов этого процесса является цистеиновая протеаза — каспаза-3. В последние годы для визуализации апоптоза в живых клетках в динамике применяют флуоресцентный имиджинг. В качестве маркеров активации каспазы-3 широко используются FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) сенсоры, которые представляют собой пару флуоресцентных белков (донор и акцептор), связанных пептидной последовательностью DEVD. При запуске апоптоза и активации каспазы-3 последовательность DEVD расщепляется и FRET-реакция становится невозможной, что сопровождается изменением интенсивности и времени жизни флуоресценции донорного белка. Применение флуоресцентных белков, работающих в красной и ближне-инфракрасной областях спектра, для исследования апоптоза в опухолях животных позволяет увеличить глубину визуализации, снизить влияние собственной флуоресценции тканей и токсическое действие зондирующего излучения.