Site icon Читальный зал

Секция №14 Биомедицинские технологии

[contents h2]

Б.А. Артыкходжаева, М.С. Ташмухамедов, Ш.У. Турдикулова

Получение молекулы PET45B-ЛДГ-II для получения рекомбинантной формы фермента лактатдегидрогеназы

Ташкентский химико-технологический институт, Узбекистан

 

Лактатдегидрогеназа используется в наборах для биохимического анализа крови. Фермент является основным компонентом набора по определению аланинаминотрансферазы.

Цель работы — клонирование гена лактатдегидрогеназы и получение рекомбинантной молекулы ДНК — pET45b-ЛДГ-II.

Материалы и методы. Суммарную РНК выделили из мышечной ткани сердца быка Bos taurus с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия). Затем выделенный ген переводили в к-ДНК форму с помощью фермента обратной транскриптазы. Полученную суммарную к-ДНК использовали для амплификации гена ЛДГ-II. Амплификацию гена ЛДГ-II выполняли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработку олигонуклеотидных праймеров для амплификации гена проводили с помощью программы OLIGO (версия 3.3) с учетом данных о первичной структуре гена LDH Bos taurus. В качестве матрицы для амплификации кодирующей области гена LDH из Bos taurus использовали последовательность данного гена из баз данных GenBank (BC151427. 1). Праймеры содержали на 5’-концах дополнительные последовательности, включающие сайты рестрикции SalI для прямого праймера и NotI для обратного, и были предназначены для амплификации и последующей встройки структурной области гена в полилинкер экспрессирующего вектора pET-45b по соответствующим сайтам. Обратный праймер был сконструирован таким образом, чтобы полученный ампликон не содержал стоп-кодон и обеспечивалась состыковка рамок считывания гена и последовательности His6. Амплифицированный ген обработали эндонуклеазами рестрикции SalI и NotI для получения липких концов. Для клонирования был выбран экспрессионный вектор pET-45b, предназначенный для экспрессии рекомбинантных белков в E. coli и содержащий ген резистентности к ампициллину.

После гидролиза эндонуклеазами рестрикции у вектора появились липкие концы, комплементарные концам амплифицированного гена ЛДГ. Выделенные продукты гидролиза рестриктазами векторной ДНК и ампликона гена ЛДГ лигировали ДНК-лигазой фага Т4. В результате была получена векторная конструкция, содержащая вставку копии гена лактатдегидрогеназы pET-45b-ЛДГ. Затем векторная конструкция трансформирована в клетки E. coli для клонирования — ТОР10 (Invitrogen). В результате трансформации и селекции на ампициллине получили колонии на агаре, которые были перенесены в 3 мл жидкой среды и культивировались 16 ч. Далее проводилось выделение плазмидной ДНК и контрольная рестрикция.

Результаты исследования. Впервые клонирован ген лактатдегидрогеназы В из сердца быка в векторные системы. Для этого осуществлен дизайн и синтез праймеров, подобраны условия амплификации, необходимые для клонирования, из суммы к-ДНК гена лактатдегидрогеназы. Была получена рекомбинантная молекула ДНК — pET45b-LDHB.

Заключение. Разработка методов генетической инженерии, позволяющих клонировать в составе молекулярных векторов отдельные гены любых организмов и вводить их в гетерологичное окружение клетки-реципиента, открыла перспективы для решения такого фундаментального вопроса биологии, как экспрессия эукариотических генов в бактериальных и дрожжевых клетках. Методами генетической инженерии созданы штаммы бактерий, дрожжей, линии клеток, с высокой эффективностью продуцирующих биологически активные белки человека и животных. Это позволяет получать эукариотические полипептиды в огромных по сравнению с недавним прошлым количествах, что упрощает процедуру их очистки вплоть до индивидуального состояния.

Получение рекомбинантной формы ЛДГ дает возможность использовать ее для производства отечественных наборов для биохимического анализа АЛТ.

 

С.С. Бачурин, Т.В. Карпенко, М.О. Кубанова, Д.И. Новикова, С.А. Мзикян, И.А. Арапов

Возможности судебно-медицинской экспертизы в оценке пятен крови, обнаруженных на месте происшествия (случай из практики)

Руководитель работы Д.П. Березовский, к.м.н., доцент, заведующий кафедрой судебной медицины

Ростовский государственный медицинский университет

 

Оценка пятен крови при осмотре места происшествия имеет огромное значение в установлении истины по делу, при восстановлении обстоятельств совершенного преступления. Большое внимание уделяется морфологии пятен крови и их локализации.

Одним из важных принципов оценки доказательств, в том числе биологического происхождения, является комплексный подход. В качестве примера мы приводим случай из собственной экспертной практики с использованием экспертного эксперимента.

02.10.20XX в садоводческом товарище «САДОВОД-ЛЮБИТЕЛЬ» был обнаружен труп мужчины Т., 1972 г.р. По данным судебно-медицинского исследования, причиной смерти явилась открытая проникающая черепно-мозговая травма (ОПЧМТ) с множественными многооскольчатыми симметричными переломами костей свода черепа и линейным переломом костей основания черепа. По полученным объективным данным можно было утверждать, что смерть потерпевшего наступила в пределах 10 мин после причинения ОПЧМТ.

07.10.20XX следователем СУ СК на данной территории был проведен дополнительный осмотр автомобиля, принадлежавшего предполагаемому обвиняемому. На дне багажника легкового автомобиля, под резиновым ковриком было обнаружено «пятно жидкой крови». Молекулярно-генетическая экспертиза установила, что обнаруженная кровь принадлежит потерпевшему. В ходе судебного разбирательства у суда возникло обоснованное сомнение в том, что данное пятно крови могло образоваться непосредственно после убийства потерпевшего 02.10.20ХХ. Для разрешения этого казуса в рамках дополнительной экспертизы мы провели экспертный эксперимент.

Научная гипотеза: в указанных выше условиях пятно крови таких размеров не могло оставаться жидким в течение 5 дней с учетом данных Гидрометцентра на конкретной территории.

Цель исследования — смоделировать указанные выше условия и проследить изменения, происходящие с пятном крови в течение пяти суток.

Материалы и методы. В багажник автомобиля, покрытие которого изготовлено из синтетического волокна (карпет), помещен автомобильный резиновый коврик. Под коврик в 5 точках (по 4 углам, на расстоянии 10 см от края и точно по середине) нанесли количество крови, достаточное для формирования пятна 18 см2. Затем пятна были аккуратно накрыты резиновым ковриком. С учетом данных судебно-медицинской экспертизы трупа, объективно подтверждающей, что смерть потерпевшего была без выраженного агонального периода, в образцы крови добавлен этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА-Na). Автомобиль был оставлен на улице на 5 суток. Благодаря портативной метеостанции и сводке о погодных условиях в районе СТ «САДОВОД-ЛЮБИТЕЛЬ» на 02.10.20XX, эксперимент удалось смоделировать в пределах ошибки эксперимента. Время проведения было выбрано таким образом, чтобы погодные условия по основным параметрам (температура, атмосферное давление, влажность) соответствовали исходным.

Результаты. На 5-е сутки было обнаружено, что все пять (!!!) экспериментальных пятен крови оказались абсолютно сухими. На поверхности карпета и резинового коврика в местах соприкосновения с кровью видны следы крови с неровными краями. Из полученных пятен крови без особых технических сложностей оказалось возможным отобрать образцы для генетического типирования.

Выводы. Для полноценной научно-обоснованной судебно-медицинской оценки следов крови требуется тщательный осмотр места происшествия с фиксацией в протоколе осмотра не только размеров и локализации пятен крови, но и ряда физических (природных) параметров. Наличие этих сведений позволит избежать ошибочной интерпретации результатов.

 

Д.М. Кузьмина1, И.И. Белоусова2

Динамика МК-801 зависимого поведения мышей после длительной блокады NMDA-рецепторов

Руководитель работы И.В. Мухина, профессор, д.м.н.

1ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»; 2Нижегородская государственная медицинская академия

 

Шизофрения — распространенное эндогенное заболевание, представляющее собой медико-биологическую проблему, поиск путей решения которой не приостанавливается в течение многих десятилетий. Поскольку глутаматергическая гипотеза развития шизофрении с 1980 г. является одной из наиболее распространенных в нейронауке, значительная часть методик моделирования шизофрении направлена на блокаду NMDA-рецепторов конкурентными и неконкурентными антагонистами. Несмотря на большой экспериментальный материал, неясными остаются адаптационные механизмы, направленные на поддержание гомеостаза нейронных сетей и изменение поведения после длительной блокады NMDA-рецепторов.

Цель исследования — изучение отдаленных последствий длительной блокады NMDA-рецепторов в отношении комплекса поведенческих реакций мышей, отражающих фенотип поведения при моделировании шизофрении в эксперименте.

Материал и методы: 30 мышей линии С57BL/6j, самцов, возраст 8 недель, неконкурентный антагонист NMDA-рецепторов — (-/-)МК-801. Использовались следующие поведенческие методики: исследование пространственной рабочей памяти (радиальный лабиринт), социальное поведение (тест Кроули), двигательной активности (Аktimeter), рабочей памяти в челночной камере (Shuttle box).

Результаты исследования. Рабочая память является частью долговременной и включает в себя кратковременную память, т.е. только ту информацию из долговременной памяти, которая находится в активной обработке. При исследовании изменений пространственной рабочей памяти в радиальном лабиринте на фоне введения препарата МК-801 было выявлено постепенное ухудшение пространственного ориентирования животного, обусловленного нарушенной работой нейронных сетей гиппокампа. Сниженная пространственная рабочая память сохранялась и в течение последующих после отмены блокатора NMDA-рецепторов 10 дней.

Социальная активность животных после 10-дневного введения МК-801 достоверно не отличалась в экспериментальной и контрольной группах, однако отмечалось увеличение вариабельности показателей социального поведения после введения МК-801.

При исследовании удаленных эффектов МК-801 на ориентировочно-исследовательскую рефлекторную активность было обнаружено достоверное различие числа вертикальных стоек у экспериментальной и контрольных групп.

Изучение рабочей памяти при формировании условного рефлекса пассивного избегания в отдаленном периоде после блокады NMDA-рецепторов не выявило различий между экспериментальной и контрольными группами, что говорит о восстановлении структуры нейронных сетей в области фронтальной коры, ответственных за хранение и извлечение долговременной памяти при формировании условного рефлекса в челночной камере.

Таким образом, курсовое введение блокатора глутаматных NMDA-рецепторов вызывает стойкое изменение поведения животных, выявленное при поведенческом фенотипировании долговременной памяти, социального и двигательного поведения. Это может быть использовано при скрининге новых психотропных препаратов, направленных на лечение психических заболеваний, в том числе шизофрении.

Выводы. МК-801 вызывает ухудшение пространственной рабочей памяти, но не рабочей памяти, исследуемой в челночной камере при формировании условного рефлекса пассивного избегания в отдаленный период после отмены блокады NMDA-рецепторов, что свидетельствует о более глубоком нарушении структуры нейронных сетей в области гиппокампа, чем фронтальной коры. Социальная активность животных через 10 дней после 10-дневного курса введения МК-801 изменяется недостоверно, однако прослеживается недостаток общительности, обнаружены резкие колебания показателей социального поведения экспериментальных животных, что свидетельствует о сохранности изменения социального поведения в отдаленном периоде после отмены блокады NMDA-рецепторов. Вертикальная двигательная активность животных, отражающая ориентировочно-исследовательский рефлекс, не восстанавливалась через 10 дней после 10-дневного курса введения МК-801.

 

 

С.А. Родимова1, 2, В.В. Дуденкова1, 2, А.В. Мелешина1, 2, Д.С. Кузнецова1, 2

Исследование состояния свободной и связанной форм НАДН мезенхимальных стромальных клеток в процессе остеогенной дифференцировки на скаффолдах методом FLIM

Руководитель работы Е.В. Загайнова, д.м.н., профессор

1 НИИ Биомедицинских технологий, НижГМА, ННГУ им. Н.И. Лобачевского;

2 ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

 

Одно из актуальных направлений современной науки — исследование метаболического статуса стволовых клеток (СК) при направленных дифференцировках. К важнейшим регуляторам дифференцировки и самообновления СК относятся энергетический обмен и окислительно-восстановительный статус в клетках. Более того, значительную роль играет клеточное микроокружение и их ниша. Стандартная модель для изучения клеточного метаболизма представляет собой клеточный монослой, который не может достаточно полно отражать поведение и свойства клеток, существующих в норме в трехмерных условиях. В качестве модели, имитирующей клеточную нишу, могли бы выступить трехмерные каркасы-скаффолды, которые в настоящее время активно исследуются в тканевой инженерии с целью устранения костных дефектов.

Большинство современных методов исследования метаболизма СК базируется на введении экзогенных меток, что представляет собой довольно травматичный процесс, который, к тому же, не дает полной информации о пролиферации и дифференцировке СК. Новой технологией для изучения клеточного метаболизма является неинвазивный, высокоспецифичный метод мультифотонной микроскопии с детекцией времени жизни флуоресценции FLIM (fluorescence lifetime imaging). Одним из самых чувствительных и информативных внутренних биомаркеров для изучения метаболизма в живых клетках служит НАДН+Н+.

Цель — изучение состояния свободной и связанной форм НАДН-мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в процессе остеогенной дифференцировки на 3D-скаффолдах методом FLIM.

Материалы и методы. Изучалась культура мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга кролика, выделенных по стандартной методике. В качестве трехмерных матриц использовали полилактидные скаффолды, полученные методом двухфотонной фотополимеризации. В ранних исследованиях показана их превосходная биосовместимость. Клетки высевали на скаффолды в количестве 50 000 на один образец, помещали готовые скаффолды с ММСК в два типа культуральных сред: стандартную (MesenCult™ Proliferation Kit) и остеогенную (MesenCult™ Osteogenic Stimulatory Kit) и культивировали в условиях CO2-инкубатора. Время жизни флуоресценции детектировали с помощью микроскопа LSM 710 (Carl Zeiss, Germany), оборудованного FLIM-системой (Simple-Tau 152, Becker&HicklGmbH, Germany), в течение 3 недель культивирования.

Результаты. Были проанализированы времена жизни флуоресценции и их вклады материала скаффолда без клеток, скаффолда с клетками и клеток в монослое (контроль). Для этого в программе SPCImage (Becker&Hickl) проводился анализ:

Показано, что в клеточном монослое времена жизни свободной и связанной форм НАДН, а также вклад связанной формы НАДН увеличивались в дифференцированных клетках, однако различия были статистически не значимы. В 3D-скаффолдах не обнаружено изменений времен жизни флуоресценции клеток и их вкладов в процессе остеогенной дифференцировки, статистически значимых различий не выявлено. Материал скаффолдов, полученных методом двухфотонной полимеризации, вносил вклад в общее время жизни флуоресценции, что не позволило зафиксировать изменение времен жизни флуоресценции клеток, адгезированных к скаффолдам, во время дифференцировки.

Выводы. Показана возможность изучения состояния свободной и связанной форм НАДН ММСК в процессе остеогенной дифференцировки методом FLIM на скаффолдах, однако данный тип матриц не может быть использован в качестве трехмерной подложки-носителя. Материал исследуемых скаффолдов имеет такие же времена жизни флуоресценции, как и клетки, адгезированные к скаффолдам.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект №14-15-00536).

 

А.С. Быстрова1, В.В. Дуденкова1, 2, Е.В. Загайнова2

Исследование внутриклеточного рН и вязкости в недифференцированных костно-мозговых мезенхимных стволовых клетках человека

Руководитель работы А.В. Мелешина, к.б.н.

1 Нижегородский государственный университет им. Лобачевского;

2 НИИ Биомедицинских технологий, НижГМА, ННГУ им. Н.И. Лобачевского

 

Идентификация и исследование структурно-функциональных свойств линий стволовых клеток человека и животных являются важнейшими задачами современной клеточной биологии и биоинженерии. Важными параметрами внутриклеточной физиологии, требующих активного изучения, являются метаболическая активность живых клеток, которая анализируется с помощью внутренних биомаркеров НАД (Ф)Н и флавинов, организация ультраструктуры цитоскелета, рН, вязкость и др. Уже были получены результаты об изменении метаболической активности мезенхимных стволовых клеток в процессе дифференцировки, однако важно изучить и другие параметры — уровень показателя рН и вязкости.

Цель — определить уровень рН и вязкости в недифференцированных костно-мозговых мезенхимных стволовых клетках человека.

Материалы и методы. Объектом исследования служила первичная культура костно-мозговых мезенхимных стволовых клеток (МСК) человека.

Для оценки уровня внутриклеточного рН был использован стандартный флуоресцентный рН-зонд BCECF. В предварительных экспериментах проведена калибровка с флуоресцентным красителем BCECF (использовались калибровочные растворы со значениями рН 6,8; 7,0; 7,2; 7,4; 7,6; 7,8; 8,0) для перевода условных единиц рН в абсолютные единицы. Для оценки уровня внутриклеточного рН МСК инкубировали с флуоресцентным красителем BCECF. Визуализация проводилась с использованием конфокального флуоресцентного микроскопа LSM710 (Carl Zeiss, Германия). Полученные изображения обрабатывали с помощью программы Image J (NIH, США).

Вязкость цитоплазматической мембраны определяли с использованием молекулярного ротора группы BODIPY. Флуоресцентные и FLIM изображения получали на микроскопе LSM710 (Carl Zeiss, Германия) с FLIM системы (Becker&Hickle GmbH). Полученные FLIM изображения обрабатывали с помощью программы SPCImage (Becker&Hickl GmbH, Германия). Изменения вязкости цитоплазматической мембраны клеток анализировали по изменению времени жизни молекулярного ротора.

Результаты исследования. Средний уровень внутриклеточного рН составило 7,6, в соответствии с калибровкой. Полученный результат согласуется с имеющимися литературными данными. Внутриклеточный рН стволовых клеток является более щелочным по сравнению с рН нормальных дифференцированных клеток и сходен с рН опухолевых клеток. Среднее значение вязкости цитоплазматической мембраны было равно 364,06±20 сПз. На сегодняшний день еще не проводилось измерений микровязкости в стволовых клетках с использованием роторов BODIPY.

Заключение. Были определены и проанализированы уровни внутриклеточного рН и вязкости в недифференцированных МСК человека. В дальнейшем планируется исследовать изменение внутриклеточного рН и вязкости в процессе дифференцировки МСК в трех направлениях: адипогенном, остеогенном и хондрогенном.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект №14-15-00536).

 

К.А. Астафьева, Е.С. Пугина, А.И. Самойлова, С.В. Трофимова

Оценка цитотоксического действия физических факторов излучения газоразрядной плазмы в экспериментах in vitro

Руководитель работы И.П. Иванова, д.б.н., зав. лабораторией физико-химических исследований

Нижегородская государственная медицинская академия; Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

 

В настоящее время проблемой практической онкологии является высокая токсичность и низкая избирательность действия противоопухолевых препаратов. Ведется поиск и разработка новых эффективных технологий с цитотоксическим действием в отношении неопластических клеток. Особый интерес представляет такой физический фактор, как излучение газоразрядной плазмы (Иванова И.П., 2006, 2014). Установлено его бактерицидное, спороцидное и цитотоксическое действие, в том числе в отношении опухолевых клеток (Иванова И.П., Трофимова С.В., 2005, 2009, 2012, 2014). Однако до настоящего времени не изучен вклад физических факторов газоразрядной плазмы в цитотоксическое действие.

Цель работы — оценка вклада физических факторов излучения газоразрядной плазмы в цитотоксический эффект в экспериментах in vitro.

Материалы и методы. В работе использовали генераторы излучения плазмы с различными характеристиками: частотой 1, 10, 50 и 100 Гц; потоком фотонов 1,26×10-10 и 5,4×10-8 моль(см2с)-1; энергией 0,05 и 5 Дж/имп. Объекты исследования: взвеси эритроцитов интактных животных и животных с лимфосаркомой Плисса ((4,8–5)×107 кл/мл); суспензии клеток лимфосаркомы Плисса (ЛСП) и рака молочной железы (РМК) (5×106 кл/мл). Суспензии клеток объемом 4 мл обрабатывали в различных временных режимах, от 30 до 3600 с. Контролем служили необработанные образцы.

Количество нежизнеспособных клеток после обработки оценивали с помощью трипанового синего (Герасимов И.Г., 2007). Гидрофобность и микровязкость мембран опухолевых клеток изучали по флуоресценции 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена и пирена (Иванова И.П., Трофимова С.В., 2014). Изменение метаболической активности опухолевых клеток исследовали по флуоресценции НАДН и ФАД+  (Иванова И.П., Трофимова С.В., 2014).

Результаты исследования. Установлено, что наиболее выраженным цитотоксическим действием в отношении эритроцитов обладают устройства с частотой 1 и 10 Гц, энергией 0,05 Дж и потоком фотонов (5,4×10)-8 моль (см2с)-1. Выявлена большая устойчивость мембран у животных с неопластическим процессом по сравнению с интактными животными. Количество жизнеспособных клеток лимфосаркомы Плисса после воздействия излучением плазмы с различными характеристиками постепенно уменьшалось с увеличением времени воздействия до 3600 с, однако 100% цитотоксического действия достигнуто не было вне зависимости от частоты, энергии в импульсе и плотности потока фотонов.

Оценка состояния мембран клеток ЛСП и РМК после воздействия излучением плазмы с различной частотой и потоком фотонов показала, что изменения гидрофобности носили разнонаправленный характер. Наиболее выраженные изменения зарегистрированы при воздействии наибольшим потоком фотонов — снижение в 5 раз. К более значительному снижению микровязкости мембран опухолевых клеток приводит излучение плазмы с низкими частотами 1 и 10 Гц и наибольшим потоком фотонов (5,4×10)-8 моль(см2с)-1. Показано, что к наибольшему накоплению восстановленного НАД·Н приводит воздействие наибольшим потоком фотонов в 5 раз по сравнению с контрольной группой. Уровень окисленного ФАД возрастал при действии частотами 1 и 10 Гц в пять и два раза соответственно, а при воздействии потоком фотонов (1,26×10)-10 моль(см2с)-1 — в два раза.

Заключение. Цитотоксический эффект излучения газоразрядной плазмы находится в прямой зависимости от плотности потока фотонов и в обратной — от частоты и энергии в импульсе. Наиболее выраженные изменения гидрофобности и микровязкости мембран клеток и их метаболический активности вызывает излучение газоразрядной плазмы с потоком фотонов (5,4×10)-10 моль(см2с)-1 и частотами 1 и 10 Гц.

 

А.А. Чичагова1, И.Н. Дружкова2, В.В. Дуденкова1,2, Н.И. Игнатова2, М.М. Лукина1,2, М.В. Ширманова1,2

Определение внутриклеточного водородного показателя опухолевых клеток при химиотерапевтическом воздействии

Руководитель работы Е.В. Загайнова, д.м.н., директор НИИ БМТ НижГМА

1Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; 2Нижегородская медицинская академия

 

Онкологические заболевания как причина смертности населения занимают второе место после заболеваний сердечно сосудистой системы. В настоящее время на территории России одобрены к применению в клинике более 100 противоопухолевых препаратов. Однако их эффективность ограничена. Серьезную проблему для лекарственной терапии злокачественных новообразований представляет множественная лекарственная устойчивость (МЛУ).

Среди причин формирования МЛУ в литературе активно обсуждается роль водородного показателя опухоли. Известно, что внутриклеточный рН опухолевых клеток является более щелочным, по сравнению с нормальными клетками организма (7,12–7,65 при норме 6,99–7,2), а внеклеточный рН опухоли — более кислым (6,2–6,9 при норме 7,3–7,4). Таким образом, на мембране опухолевых клеток формируется обратный градиент pH, обеспечивающий увеличение пролиферативной активности, уклонение от апоптоза и невосприимчивость к лекарственным препаратам.

В ряде исследований показано, что в результате химиотерапевтического воздействия наблюдается закисление цитоплазмы опухолевых клеток. Однако ранний ответ на химиотерапевтическое воздействие не был широко изучен и представляет интерес как с теоретической, так и с практической точек зрения.

Самыми распространенными в клинической практике являются химиопрепараты, оказывающие неспецифическое цитостатическое и цитотоксическое воздействие.

Цель  исследования — изучение изменения внутриклеточного водородного показателя при воздействии химиотерапевтических препаратов на примере клеток опухоли аденокарциномы шейки матки человека.

Материалы и методы. В исследовании использована клеточная линия рака шейки матки человека HelaKyoto, трансфецированная геном желтого флуоресцентного белка-сенсора SypHer2. Данный флуоресцентный сенсор имеет два пика возбуждения флуоресценции (420 и 500 нм) и пик эмиссии на 516 нм. Химиотерапевтическое воздействие оказывали препаратами таксол (цитостатическое действие) и цисплатин (цитотоксическое действие). Лекарственную чувствительности клеток оценивали с помощью колориметрического теста для оценки метаболической активности клеток (МТТ-тест). Визуализацию флуоресцентного генетически кодируемого сенсора производили с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM-710 (Carl Zeiss, Germany).

Результаты исследования. На первом этапе работы были установлены полулетальные дозы препаратов и проведена калибровка сигнала сенсора SypHer2 с использованием серии буферных растворов.

Было установлено, что динамика внутриклеточного рН при добавлении препаратов таксол и цисплатин отличается. Через 40 мин после добавления таксола внутриклеточный рН изменяется в щелочную сторону, с 7,28±0,10 до 7,53±0,13, затем постепенно снижается до 7,15±0,13 через 24 ч после добавления препарата.

При добавлении цисплатина в течение 3 ч наблюдается снижение внутриклеточного рН (минимальное значение 7,16±0,05), затем увеличение до 7,4±0,07 к 4 ч после добавления препарата. Через 24 ч внутриклеточный рН снижается до 7,16±0,14.

Статистическую обработку данных проводили минимум по 50 клеткам для каждой исследуемой точки.

Заключение. Определено изменение внутриклеточного водородного показателя опухолевых клеток рака шейки матки человека при воздействии химиотерапевтическими препаратами разного механизма действия. При раннем ответе опухолевых клеток на химиотерапию наблюдается защелачивание цитоплазмы, при этом динамика развития данной реакции отличается для двух препаратов. Полученные данные представляют интерес для понимания механизма действия препаратов и повышения их эффективности.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 14-25-00129.

 

Д.А. Логинова, А.Д. Крайнов, П.Д. Агрба, М.Ю. Кириллин

Моделирование спектральных характеристик биоткани мозга лабораторной мыши

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород

 

Цель работы: моделирование спектральных характеристик биоткани мозга лабораторной мыши в видимом и ближнем ИК-диапазонах оптическими фантомами, состоящими из модельных сред: липофундина МСТ/ЛСТ 20%, поглотителей с различными спектральными зависимостями.

Материалы и методы. Спектральные характеристики биоткани мозга лабораторной мыши измерялись на образце, полученном ex vivo и предварительно гомогенизированном. Восстановленные оптические свойства, находящиеся в соответствии с данными литературы, использовались в качестве базовых при разработке фантомов.

Оптический фантом представляет собой водный раствор липофундина МСТ/ЛСТ 20%, тушей красной, черной, синей и цвета фуксии, спектральные характеристики которых были предварительно измерены и сопоставлены со спектрами образца биоткани.

Спектральные характеристики, такие как коллимированное и диффузное пропускание, диффузное отражение, были оценены методом спектрофотометрии с помощью спектрофотометра Analytikjena Specord 250 plus с применением интегрирующей сферы. Восстановление оптических свойств — коэффициентов поглощения и рассеяния — производилось в соответствии с методикой, основанной на приближении малократного рассеяния и модифицированном законе Бугера-Ламберта-Бера.

Результаты исследования. Спектр поглощения мозга мыши имеет характерные особенности, обусловленные спектром поглощения гемоглобина. Вид спектральной зависимости определяется соотношением концентрации оксигенированного гемоглобина HbO2, имеющего два характерных пика поглощения с максимумами на длинах волн 542 и 576 нм, и деоксигенированного гемоглобина Hb, которому свойственен один максимум на длине волны 556 нм.

Спектры поглощения красной туши и цвета фуксии имеют два резких пика в зелено-желтой области спектра: 520 и 560 нм для красной, 535 и 565 нм для туши цвета фуксии. В красном и ближнем ИК-диапазонах поглощение незначительно. Для синей туши пик поглощения отмечается около 600 нм, а также на длине волны 700 нм. Данные особенности позволяют наиболее точно смоделировать спектральные характеристики гемоглобина.

На базе спектров поглощения и рассеяния образца биоткани и модельных сред было подобрано соотношение концентраций компонентов фантома, которое обеспечивает оптические свойства, близкие к значениям характеристик мозга лабораторной мыши. Разработанный фантом представляет собой оптически стабильную среду. Образец фантома хранился при температуре +4Сº. Сравнение оптических свойств фантома сразу после приготовления и через неделю показало, что отклонение значений не превышает 5%.

Заключение. В результате был разработан фантом, моделирующий оптические свойства биоткани мозга лабораторной мыши в диапазоне 400–1100 нм. Расхождение в оптических свойствах фантома и биоткани мозга не превышает в среднем 20%. Имитация фантомом свойств биоткани в видимом и ближнем ИК-диапазонах позволяет использовать его в установках оптической диффузионной томографии с целью их калибровки и проведения опорных измерений, а также для апробации методов и сравнения эффективности различных систем.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проекты 15-32-20227 и 15-02-04270).

 

Г.С. Перельман1, О.А. Злобовская2, В.В. Дуденкова1,3, М.В. Ширманова1

Исследование апоптоза в экспериментальных опухолях животных с помощью генетически кодируемого FRET-сенсора активности каспазы-3

Руководитель работы Т.Ф. Сергеева, к.б.н., научный сотрудник

1Нижегородский национальный исследовательский университет им. Н.И. Лобачевского;

2Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН, Москва;

3Нижегородская государственная медицинская академия

 

Апоптоз представляет собой регулируемый процесс программируемой клеточной гибели. Одним из основных ферментов этого процесса является цистеиновая протеаза — каспаза-3. В последние годы для визуализации апоптоза в живых клетках в динамике применяют флуоресцентный имиджинг. В качестве маркеров активации каспазы-3 широко используются FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) сенсоры, которые представляют собой пару флуоресцентных белков (донор и акцептор), связанных пептидной последовательностью DEVD. При запуске апоптоза и активации каспазы-3 последовательность DEVD расщепляется и FRET-реакция становится невозможной, что сопровождается изменением интенсивности и времени жизни флуоресценции донорного белка. Применение флуоресцентных белков, работающих в красной и ближне-инфракрасной областях спектра, для исследования апоптоза в опухолях животных позволяет увеличить глубину визуализации, снизить влияние собственной флуоресценции тканей и токсическое действие зондирующего излучения.

Оценка активности каспазы-3 с помощью FRET-сенсоров может найти применение в медицине как способ ранней детекции запуска апоптоза в опухолевых клетках и стать одним из показателей эффективности лечения.

Цель работы — оценка возможности регистрации FRET-сигнала сенсора активности каспазы-3 в экспериментальной опухоли животных методом флуоресцентного биоимиджинга.

Материалы и методы. Для исследования был использован FRET-сенсор на основе mKate2 (дальнекрасный GFP-подобный флуоресцентный белок в качестве донора) и iRFP (инфракрасный флуоресцентный белок в качестве акцептора). Объектом исследования выступали самцы и самки мышей Balb/c массой 18–20 г. Были сформированы следующие группы животных:

Для получения опухолевой модели в область бедра животным осуществлялась подкожная или внутримышечная инъекция 500 тыс., 1 млн. и 2 млн. опухолевых клеток, растворенных в 100 мкл PBS. Открытие опухоли осуществляли под наркозом (золетил-рометар, 60 мкл внутримышечно). Для подбора оптимальных длин волн возбуждения и эмиссии FRET-сенсора методом поверхностного флуоресцентного имиджинга использовалась установка IVIS­Spectrum (Caliper Life Sciences, США). Анализ сигнала флуоресценции проводили в программе LivingImage.

Результаты исследования. Было установлено, что для mKate2 (донор) наибольшая интенсивность флуоресценции наблюдалась при длинах волн возбуждения и эмиссии 570 и 640 нм соответственно; для iRFP (акцептор) флуоресценцию возбуждали на длине волны 570 нм, принимали на длине волны 720 нм; во FRET-паре возбуждение донора и эмиссия акцептора были отмечены при длинах волн 570 и 720 нм соответственно. На подобранных настройках осуществляли контроль флуоресценции опухолей в процессе роста методом поверхностного флуоресцентного имиджинга.

Было выявлено отсутствие флуоресценции в опухоли СТ26 без сенсора (контрольная группа) при разных длинах волн возбуждения и эмиссии. В отличие от контрольной группы у животных с опухолями СТ26 с сенсором mKate2—DEVD—iRFP интенсивность флуоресценции изменялась в разные дни роста опухоли.

С целью сравнить интенсивность флуоресценции FRET-сенсора (mKate2-DEVD-iRFP) были выполнены измерения на животных с опухолью, закрытой кожей, и опухолью с открытой кожей. С помощью программы EMBL ImageJ оценивали отношение интенсивности флуоресценции донора к флуоресценции FRET-пары. Установлено, что интенсивность флуоресценции в опухоли неравномерная, что указывает на неоднородность опухолевой ткани. Сравнение отношения интенсивности флуоресценции донора к флуоресценции FRET-пары в опухоли, закрытой кожей, и в опухоли с открытой кожей показало, что они соответствуют друг другу. Это указывает на возможность регистрации флуоресцентного сигнала в опухоли, закрытой кожей.

Заключение. Была разработана методика детекции FRET-сигнала по соотношению дальнекрасной и инфракрасной флуоресценции каспазного сенсора mKate2—DEVD—iRFP в опухолях животных на основе флуоресцентного молекулярного имиджинга.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект №14-25-00129).

 

В.В. Бережной

Биологические свойства эфирных масел, выделенных из растений семейства Artemisia

Руководитель работы С.Б. Ахметова, зав. кафедрой микробиологии, к.м.н., доцент

Карагандинский государственный медицинский университет, Казахстан

 

Поиск биологической активности среди эфирных масел флоры Казахстана обоснован неугасающим интересом к этой группе источников природных фитонцидов. Объектом исследований стали эфирные масла — Artemisia kazakorum, Artemisia latifolia, Artemisia hipoliti. Растения произрастают на территории Казахстана, образцы масел наработаны в АО «МНПХ Фитохимия» (г. Караганда) и предоставлены профессором Г.А. Атажановой. Эти образцы проявляют умеренно-выраженную активность в отношении грамположительных штаммов (S. aureus, B. subtilis).

Цель исследования — изучение противогрибковой активности эфирных масел с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Материал и методы. Антифунгальную активность исследовали в соответствии с методикой изучения спектра антифунгального действия противогрибковых препаратов методом серийных разведений с определением МПК. Препараты сравнения: эфирное масло эвкалипта, нитрофунгин, контроль ДМСО.

Результаты исследования. Противогрибковую активность показали эфирное масло Artemisia kazakorum, Artemisia latifolia, Artemisia hipoliti. МПК составила 0,16–0,64 мг/мл, эфирное масло Artemisia kazakorum в концентрации 2,5 мг/мл действовало на T. rubrum, 2,0 мг/мл — на T. mentagrophytes var. gypseum; 2,0 мг/мл — M. canis, для C. аlbicans фунгицидный титр составил 2,0 мг/мл. Эфирное масло Artemisia latifolia проявило фунгицидные свойства в отношении T. rubrum — в концентрации 3,0 мг/мл, для M. canis и C. аlbicans —2,0 мг/мл.

Выводы. Представленные эфирные масла —Artemisia kazakorum, Artemisia latifolia, Artemisia hipoliti — рекомендованы к дальнейшему доклиническому изучению для создания перспективных лекарственных противогрибковых препаратов.

 

О.Е. Фурман1, Н.В. Клементьева2, А.С. Мишин3

Исследование ультраструктуры цитоскелета опухолевых клеток при воздействии противоопухолевых препаратов методом высокоразрешающей микроскопии

Руководитель работы Е.B. Загайнова, д.м.н., директор НИИ БМТ НижГМА

1Нижегородский национальный исследовательский государственный университет им. Н.И. Лобачевского;

2Нижегородская государственная медицинская академия;

3Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

 

Важным звеном при лечении злокачественных образований является создание противоопухолевых агентов, целенаправленно воздействующих на мишени, определяющие фенотип клетки. Такой мишенью может стать цитоскелет, а именно актин и актин-связывающие белки. В связи с тем, что актиновый цитоскелет представляет собой обширную сеть тончайших микрофламентов и подвержен динамическим перестройкам, необходимы высокоточные методы его визуализации. Поэтому актуальной задачей становится эффективное приложение методов высокоразрешающей микроскопии к исследованию ультраструктуры цитоскелета опухолевых клеток, подвергшихся воздействию химиопрепаратов.

Цель работы — анализ ультраструктуры актинового цитоскелета опухолевых клеток под воздействием различных противоопухолевых препаратов и экспериментальных химических агентов методом высокоразрешающей микроскопии.

Материалы и методы. В работе использовались химиотерапевтические препараты цисплатин (Тева, 0,5 мг/мл) и таксол (Bristol-Myers Squibb, 6 мг/мл), а также экспериментальные химические агенты ясплакинолид (Enzo Life Sciences, 1 мM) и цитохалазин Д (Enzo Life Sciences, 25 мг/мл).

Эксперименты проводились на клеточной линии HeLa Kyoto (рак шейки матки человека). Моделью исследований выступал актин-связывающий белок альфа-актинин, меченный красным флуоресцентным белком TagRFP. Применялись следующие методы: ведение культур эукариотических клеток, временная трансфекция клеток, МТТ-тест, флуоресцентная локализационная микроскопия единичных молекул, обработка данных с помощью программного обеспечения ImageJ и μManager.

Результаты. На первом этапе работы с помощью МТТ-теста были установлены полулетальные концентрации цисплатина (7 мкмоль/л), таксола (0,078 мкг/мл), ясплакинолида (0,2 мкмоль/л) и цитохалазина Д (7,75 мкг/мл) для клеток HeLaKyoto. Затем была получена линия клеток HeLaKyoto, временно экспрессирующая флуоресцентный белок TagRFP, слитый с альфа-актинином. Ранее нами было показано, что флуоресцентный белок TagRFP способен спонтанно переходить из темнового во флуоресцентное состояние при облучении 561 нм лазером низкой мощности. Для осуществления локализационной микроскопии единичных молекул на основе TagRFP мы получали серии последовательных изображений флуоресцирующих клеток, в среднем по 3000–5000 кадров. Впоследствии были реконструированы изображения данных клеток со сверхвысоким разрешением.

Была визуализирована структура альфа-актинина в опухолевых клетках HeLa Kyoto-TagRFP-actinin в контрольном образце (без добавления препарата) и в опытных образцах (с добавлением исследуемых препаратов в полулетальных концентрациях). Оценка ультраструктурных изменений цитоскелета проводилась в двух временных точках — через 1–3 и 18–24 ч инкубации клеток с препаратом.

При инкубации с таксолом наблюдался цитостатический эффект, а именно образование реорганизованных скоплений микрофиламентов. В случае с цисплатином характер исчерченности и упорядоченности актинового цитоскелета менялся в сторону хаотичности.

В случае с ясплакинолидом наблюдалось образование большего количество сшивок альфа-актинина, так как данный препарат стимулирует полимеризацию актиновых филаментов. После воздействия цитохалазина Д происходила быстрая агрегация концов микрофиламентов, а также блокировалось формирование различных выступов клетки, таких как филоподии.

Выводы. С помощью высокоразрешающей локализационной микроскопии с применением флуоресцентного белка TagRFP визуализирована структура альфа-актинина в опухолевых клетках HeLa Kyoto и проанализированы ее ультратонкие изменения при воздействии противоопухолевых препаратов — таксол и цисплатин, и экспериментальных химических агентов — ясплакинолид и цитохалазин Д.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 14-25-00129.

 

Н.П. Павлова1,2, М.М. Карабут2, В.В. Елагин2, М.А. Сироткина2, Л.А. Матвеев2,3, А.В. Шумилова1,2

Применение метода мультимодальной ОКТ для оценки эффективности лучевой терапии химически индуцированной опухоли

Руководитель работы Н.Д. Гладкова, заместитель директора по науке НИИ БМТ, д.м.н., профессор

1ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»;

2НИИ Биомедицинских технологий, Нижегородская государственная медицинская академия;

3ФГБУН Институт прикладной физики РАН, г. Нижний Новгород

 

Оптические методы диагностики состояния тканей могут обнаруживать биохимические и морфологические изменения, связанные с ответом опухоли на лечение. Так, оценка первичного ответа на лечение позволила бы повысить его эффективность. Одним из оптических методов, который может быть применен для решения подобных задач, является мультимодальная оптическая когерентная томография (ММ ОКТ), прижизненный неинвазивный метод диагностики.

Цель работы — оценить возможности метода ММ ОКТ в оценке эффективности лучевой терапии (ЛТ) химически индуцированной опухоли защечного мешка хомяка.

Материалы и методы. Эксперименты проводились на самках золотых сирийских хомяков. Химическое индуцирование опухоли осуществляли путем нанесения 0,5% раствора 9,10-диметил-1,2-бензантроцена в минеральном масле на левый защечный мешок хомяка 3 раза в неделю в течение 12 недель.

Исследования выполнены на ММ ОКТ-устройстве с использованием спектрального принципа приема сигнала, разработанном в ИПФ РАН (г. Нижний Новгород). ММ ОКТ включает два вида визуализации: кросс-поляризационную ОКТ (КП ОКТ), которая регистрирует кросс-рассеяние и двулучепреломление, и микроангиографическую ОКТ (МА ОКТ), которая демонстрирует картину микроциркуляторного русла.

Радиационное облучение осуществляли на аппарате гамма-облучения фракционно по 7 Гр в неделю до достижения суммарной дозы 21 Гр. Состояние ткани оценивали через 24 ч после каждого облучения, а при достижении дозы 21 Гр — еженедельно. Материал для гистологического анализа забирали через 48, 72 ч и на 8, 14, 28-е и 35-е сутки после окончания лечения. Для верификации состояния ткани проводилось параллельное сопоставление ОКТ-изображений с гистологическими препаратами. По данным КП ОКТ-изображений рассчитывался интегральный фактор деполяризации (ИФД), безразмерный параметр, характеризующий способность биоткани изменять поляризацию отраженного или рассеянного назад излучения, с использованием программы MatLab.

Результаты исследования. Показано, что КП ОКТ-изображения опухоли характеризуются бесструктурностью и неравномерным уровнем сигнала, а также его быстрым спаданием по глубине до уровня фона. Их визуальная оценка затруднена, что не дает возможность проанализировать процессы, происходящие в опухоли. Известно, что радиационное облучение, воздействуя на ткани, меняет их поляризационные свойства. В связи с этим предпринималась попытка количественной оценки поляризационных характеристик по В-сканам путем расчета ИФД. Выявлено, что критерием эффективности ЛТ может служить уменьшение численного значения ИФД — по изменению ОКТ-сигнала опухоли можно оценить степень ее повреждения и установить, насколько облучение было эффективно.

По данным ОКТ МА-изображений опухоль до ЛТ богата сосудами, которые к 8-м суткам после облучения тромбируются, что приводит к полному исчезновению сосудов на изображении вплоть до 21-х суток.

При гистологическом анализе обнаружено, что нарастание изменений вследствие облучения в наиболее значительной мере происходит в кровеносных сосудах и соединительной ткани, в то время как клеточный компонент опухоли практически не реагирует. К тотальному коагуляционному некрозу опухоли приводит не прямая гибель клеток, а гибель клеток вследствие расстройства кровообращения. Все выявленные методом ММ ОКТ изменения опухоли подтверждены гистологическими данными.

Заключение. Метод ММ ОКТ прижизненно и объективно отражает процессы, происходящие в опухоли в ответ на лучевую терапию, поэтому in vivo мониторинг эффекта ЛТ с помощью ММ ОКТ может быть крайне полезен для прогнозирования ответа ткани на облучение. Вычисление ИФД дает информацию об изменениях в ткани в ходе ЛТ, что может быть использовано для оценки эффекта терапии в реальном времени.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Правительства РФ № 14.В25.31.0015 и РФФИ грант №16-34-00995.

 

Л.Е. Шимолина1,2, М.К. Куимова3

Исследование вязкости опухолевых клеток с помощью молекулярного ротора BODIPY-C10 in vivo

Руководитель работы М.В. Ширманова, к.б.н., заведующая лабораторией индивидуальной химиотерапии рака НИИ БМТ НижГМА

1Нижегородская государственная медицинская академия;

2Нижегородский национальный исследовательский государственный университет им. Н.И.Лобачевского;

3Имперский колледж Лондона, Великобритания

 

Вязкость является важнейшим параметром биологических систем, поскольку ее изменение может быть связано с серьезными нарушениями морфологического или физиологического состояния клетки. Измерение локальной вязкости в клетках в реальном времени стало возможно благодаря развитию методов флуоресцентного биоимиджинга и появлению флуоресцентных молекулярных роторов. Также актуален вопрос о поиске эффективных биосовместимых солюбилизаторов для гидрофобных молекулярных роторов.

Цель работы — исследование фармакокинетики и биораспределения флуоресцентного молекулярного ротора BODIPY-C10, солюбилизированного полимерными щетками, в организме лабораторных животных, а также исследование времени жизни флуоресценции ротора в экспериментальной опухоли методом FLIM (Fluorescence Life-time Imaging Microscopy).

Материалы и методы. Исследование было выполнено на мышах линии Balb/с с подкожно привитой опухолью CT26. Молекулярный ротор BODIPY-C10 в виде водного раствора вводили животным внутривенно в дозе 5 мг/кг. Количественное определение ротора в плазме крови осуществляли методом спектрофлуориметрии, забирая кровь из ретроорбитального синуса через 0,1, 1, 2, 4, 6 ч после введения препарата. Флуоресцентные изображения животных получали на установке IVIS-Spectrum (Caliper Life Sciences, США). Флуоресценцию ротора возбуждали на длине волны 500 нм, сигнал принимали на 540 нм, экспозиция 2 с. Изображения получали до внутривенного введения ротора, через 10 мин, 1, 2, 5, 24, 48, 144 ч после инъекции. Для двухфотонной флуоресцентной микроскопии и FLIM использовали многофотонный томограф MPTflex (JenLab, Германия). Флуоресценцию возбуждали фемтосекундным лазером на длине волны 800 нм при мощности лазера 12 мВт и регистрировали в диапазоне 409–680 нм. Проводили мониторинг определенного участка в течение 2,5 ч, регистрируя многофотонные и FLIM-изображения каждые 15 мин после введения ротора, через 5 и 24 ч.

Результаты исследования. Молекулярный ротор BODIPY-C10 циркулирует в кровяном русле более 24 ч, период полувыведения из крови составляет 2,5 ч. Обнаружено, что ротор активно накапливается в опухоли мышей СТ26. Максимум накопления в опухолевой ткани составляет 2 ч. Высокое накопление препарата выявлено в печени, кишечнике и коже.

Разработанная ранее методика наблюдения ротора BODIPY-C10 в опухоли мышей методом FLIM позволила получить серию изображений FLIM с поверхности опухоли. Показано, что в течение первых часов BODIPY-C10 имеет диффузный характер распределения в клетках опухоли. Через 24 ч ротор обнаруживается в клетках в виде гранул, предположительно являющихся эндосомами. Характерное время жизни BODIPY-C10 в опухолевых клетках составляет 2,1—2,3 нс, что по калибровочному графику соответствует вязкости 235–285 сП.

Заключение. В ходе исследования были получены данные о фармакокинетике, биораспределении и времени жизни флуоресценции молекулярного ротора BODIPY-С10, солюбилизированного полимерными щётками. По FLIM-изображениям была прижизненно оценена интегральная величина вязкости, которая может служить полезным инструментом для определения эффективности противоопухолевой терапии. Работа поддержана РФФИ (проект № 15-02-05189).

 

М.А. Пасухин1, П.Д. Агрба1, М.Ю. Кириллин2

Численная обработка диагностических ОКТ-изображений кожи человека в норме и при патологии

1ННГУ им. Н.И. Лобачевского; 2ИПФ РАН, Нижний Новгород

 

Визуализация биотканей методом оптической когерентной томографии (ОКТ) находит широкое применение в различных областях диагностики. Метод основан на низкокогерентной интерферометрии и позволяет получать информацию о внутренней структуре биоткани на глубинах до 2 мм с пространственным разрешением до единиц микрон. Наличие структурных различий в нормальной и патологической биоткани обуславливает различие соответствующих ОКТ-изображений. Однако в процессе оценки ОКТ-изображений огромную роль играет квалификация специалиста, поэтому возникает вопрос об алгоритме анализа ОКТ-изображений, лишенном субъективности.

Один из методов объективной оценки ОКТ-изображений — оценка распределения пикселей по уровням интенсивности ОКТ-сигнала (гистограммы). Изменения в биоткани (наличие патологий, изменение внешних условий) приводят к изменению на ОКТ-изображениях, что, в свою очередь, влияет на гистограмму ОКТ-изображения. Изменения гистограмм могут быть использованы для автоматизации процесса диагностики.

Цель — разработка алгоритма численного анализа диагностических ОКТ-изображений кожи, основанного на анализе гистограмм.

Материалы и методы. Для выделения полезного сигнала ОКТ-изображение делилось на две части: часть с полезным сигналом и часть, где присутствует только шумовая компонента. Для каждой части отдельно строилась гистограмма. Считалось, что шумовая компонента равномерно распределена по всему изображению и для уменьшения ее вклада из гистограммы сигнала с шумом вычиталась гистограмма шумовой компоненты, взятой с коэффициентом так, чтобы гистограммы шума и полного ОКТ-изображения совпадали в области малых значений интенсивности, соответствующих уровню шума.

После вычитания гистограмма аппроксимировалась суммой двух распределений Гаусса с шестью параметрами (для каждой экспоненты это амплитуда, смещение, ширина распределения). Данные параметры рассматривались в качестве характеристик ОКТ-изображения, и изменения ОКТ-изображений оценивалось по изменениям параметров функции.

На первом этапе исследовались ОКТ-изображения нормальной кожи человека при трех внешних воздействиях: компрессия, предварительный нагрев поверхности кожи до температуры 45°С и предварительное охлаждение поверхности кожи до 0°С. Изображения снимались с периодом 1 мин на протяжении 7 мин, что позволило проследить их изменение во времени.

На втором этапе исследовалась кожа с патологиями: псориазом и склеродермией. ОКТ-изображения снимались в процессе лечения каждые 5 дней: сканировался очага патологии и, в качестве контроля, участок здоровой кожи, расположенный в 1 см от границы патологии.

Результаты. При исследовании нормальной кожи были выявлены характерные для каждого воздействия изменения гистограмм. При компрессии наблюдали увеличение амплитуды максимума первой компоненты, смещение максимума второй компоненты в область более высоких интенсивностей и увеличение ее ширины. Для охлаждения было получено уменьшение амплитуды первой компоненты, а также увеличение параметров положения и ширины второй компоненты. При нагреве у первой компоненты увеличивается амплитуда, у второй — происходит увеличение смещения и ширины и уменьшение амплитуды максимума, что соответствует сдвигу вправо. Изменения первой компоненты связаны с изменением характеристик шума и глубины визуализации ОКТ-изображения. Изменения второй компоненты обусловлены изменениями в структуре биоткани.

При исследовании больной кожи также выявлены изменения параметров гистограмм. В процессе терапии при псориазе наблюдалось увеличение амплитуд максимумов обеих компонент, а также уменьшение ширины второй компоненты. При склеродермии уменьшался максимум первой компоненты, происходило смещение положений первой компоненты вправо, а второй — влево, а также уменьшалась ширина второй компоненты.

Выводы. При изменении внешних условий при сканировании нормальной кожи, а также больной кожи были получены характерные изменения параметров гистограмм для каждого случая. Таким образом, данный алгоритм обработки ОКТ-изображений может служить адекватным методом анализа состояния биоткани.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 15-32-20250 и 15-42-02503.

 

М.Ю. Елизарова, И.С. Матвеев

Совершенствование методики обследования пациента с нарушениями кровообращения с помощью комплексного использования неинвазивных методов диагностики

Руководители работы — К.С. Петрова (к.м.н., доцент кафедры кожных и венерических болезней; С.В. Немирова (к.м.н., доцент кафедры госпитальной хирургии им. Б.А. Королева)

Нижегородская государственная медицинская академия

 

Цель работы — дополнить методику стандартного комплексного обследования пациента с различными видами сосудистой недостаточности неинвазивными методами исследования: аппарат для определения функционального состояния кожи (показатели влажности, сальности, пигментации, эритемы, температуры, эластичности, трансэпидермальной потери воды), лазерный анализатор капиллярного кровообращения (ЛАКК) в исследуемых участках (середина голени, середина тыла стопы) — с целью выявления патологических изменений в микроциркуляторном русле кожи.

Материалы и методы. В ходе работы использовали мультифункциональный комбайн определения функционального состояния кожи «Multi skin test center MC750» и лазерный анализатор капиллярного кровообращения «ЛАКК».

Изучали истории болезни пациентов с минимальной венозной недостаточностью и хронической венозной недостаточностью (ХВН) разной степени выраженности. У всех пациентов было получено добровольное информированное письменное согласие на выполнение исследования. Обследовано 20 человек в возрасте от 20 до 65 лет, из них 8 мужчин, 12 женщин.

Проводилось измерение показателей микроциркуляторного русла (МЦР) в исследуемых участках и показателей функционального состояния кожи в этих же областях. Полученные данные мы заносили в электронный протокол исследования. Результаты обрабатывали с помощью Microsoft Excel, Multi skin test center MC750, LDF-3.

Данные функционального исследования имеют вспомогательное значение для оценки наличия/отсутствия воспалительных изменений в исследуемом участке (показатели эритемы), степени выраженности вторичных изменений кожи, свидетельствующих о тяжести процесса (пигментация), об ишемических изменениях кожи и, как следствие, об изменении деятельности железистого аппарата (влажность, сальность).

Результаты. У пациентов в группе ХВН средней и тяжелой степени, в том числе при отсутствии видимых изменений на коже, при ОКТ-исследовании количество и диаметр сосудов МЦР было выше, чем у предыдущей группы. Признаки отека выражены более четко. Показатели ЛАКК составили 8.4 пф. ед. (см. таблицу).

Результаты обследования пациентов с различными формами сосудистой недостаточности

Показатель Минимальная венозная недостаточность ХВН средней и тяжелой степени
ЛАКК, пф.ед. 4,4 8,4
Меланин
на голени 31,1 32,5
на стопе 34,6 37,5
Эритема
на голени 9,4 10,5
на стопе 17,3 21,5
Эластичность
на голени 54,7 56,1
на стопе 65,7 –
Температура
на голени 31,1 31,2
на стопе 30,6 31,2
Влажность
на голени 41,0 37,5
на стопе 33,1 27,0
Сальность
на голени 18,7 27,6
на стопе 25,0 29,3

 

Показатели функционального состояния кожи в большинстве случаев отличались от нормы (снижение эластичности, уменьшение влажности, увеличение эритемы, меланина, температуры на стопах и сальности.

Выводы. Комплексное обследование пациента с ХВН с использованием ЛАКК и функциональных показателей позволяет расширить спектр информации о состоянии МЦР и выявить скрытые изменения железистого аппарата, что потенциально свидетельствует об ишемизации ткани и способно определить минимальные признаки клинически не выявленных изменений.