А.И. Кульчицкая, И.Г. Сметанкин
Изменения кислотно-щелочного баланса стекловидного тела у больных возрастной макулярной дегенерацией
Руководитель работы И.Г. Сметанкин, д.м.н., доцент, заведующий кафедрой глазных болезней и болезней уха горла и носа
Нижегородская государственная медицинская академия
Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) представляет собой хронический дегенеративный процесс в хориокапиллярном слое, мембране Бруха, пигментном эпителии.
Этиология ВМД неизвестна. Многие авторы придерживаются мнения, что ВМД ассоциируется с патологией артериальных сосудов. Другие считают, что вероятность развития заболевания зависит от дисбаланса окислительно-восстановительных процессов на фоне дефицита локальной или общей антиоксидантной системы, а одним из пусковых механизмов является оксидантный стресс.
Поскольку процессы свободно-радикального окисления влияют на состояние кислотно-щелочного равновесия, цель нашей работы — исследовать кислотно-щелочной баланс стекловидного тела (СТ) у больных ВМД.
Материал и методы. Исследования проведены на 48 глазах 48 пациентов с ВМД и помутнениями хрусталиков. Всем больным выполнена закрытая субтотальная витрэктомия, экстракапсулярная экстракция катаракты, имплантация заднекамерной интраокулярной линзы.
Методика определения кислотно-щелочного равновесия: рН-метрия стекловидного тела in vivo и in vitro. In vivo рН-метрию проводили игольчатым электродом из высокочистой сурьмы и стеклянным (хлорсеребряным) электродом сравнения, заполненным 0,1% стерильным раствором хлорида калия; диаметр электродов составил соответственно 1,5 и 2,0 мм. Электроды вводили перед витрэктомией в разрезы склеры в области проекции плоской части цилиарного тела. Измерения осуществляли на приборе рН-340. In vitro измерения рН стекловидного тела оценивали на газоанализаторах “AVL-990” и «Radiometer». СТ забирали во время операции в количестве около 0,4 мл при помощи наконечника витреотома.
Анализ результатов подвергался обработке по рекомендованным методикам.
Результаты. В послеоперационном периоде не было реакций со стороны радужной оболочки и цилиарного тела. Клинически глаза успокаивались на 2–4-е сутки с момента операции. Результаты рН-метрии стекловидного тела in vitro (in vivo):
- у 24 больных 7,29–7,54 (7,34-7,46);
- у 6 больных 7,29-7,61 (7,41-7,60);
- у 8 пациентов 7,54-7,61 (7,54-7,60);
- у 7 пациентов 7,34-7,30.
Норма рН СТ по данным Я.И. Глинчука (1987) составляет 7,240±0,027. Таким образом, при рН-метрии СТ мы выявили алкалоз в пределах 7,29-7,61. Данные измерений in vivo и in vitro отличались незначительно. Степень биохимических изменений зависела от стадии ВМД: при более выраженных хориоретинальных изменениях степень алкалоза СТ была значительнее. По нашему мнению, при ВМД на фоне повреждения фоторецепторов и, следовательно, нарушения физиологической антиоксидантной (защитной) системы сетчатки происходит усиление ПОЛ, в результате чего в тканях накапливается свободнорадикальный кислород. В ответ на это развивается компенсаторная (защитная) реакция с участием антиоксидантов, связывающих свободнорадикальный кислород, в результате чего происходит защелачивание среды.
Алкалоз, в свою очередь, вызывая усиление протеолитической активности и повреждение мембранных структур, потенцирует развитие и прогрессирование дегенерации. Алкалоз оказывает регуляторное влияние на компенсаторные процессы в тканях, в основе которого лежит усиление свободнорадикального окисления, перекисного окисления липидов, заключающиеся в дефиците восстановительных эквивалентов.
В отличие от гипотезы А.М. Солдатовой, наши исследования и заключения по их данным показывают, что при ВМД имеет место дефицит восстановительных эквивалентов и физиологической антиоксидантной системы не только организма в целом, но и непосредственно световоспринимающего аппарата, как следствие повреждения пигментного эпителия сетчатки (ПЭС). Причиной повреждения и атрофии ПЭС может быть фотоинициирование свободнорадикальных процессов или гипоксия, развившаяся на фоне локальной хороидальной ишемии. Не исключена комбинация этих двух или других факторов.
Выводы. Биохимические изменения стекловидного тела при ВМД проявляются алкалозом, причиной которого могут быть компенсаторные реакции на фоне патологических свободнорадикальных, окислительно-восстановительных процессов и дефицита восстановительных эквивалентов.
Е.В. Балавина
Оценка фосфолипидного спектра крови больных со злокачественными опухолями различной локализации
Руководитель работы Т.А. Веселова, к.б.н., доцент кафедры биохимии и физиологии ИББМ
ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
В последнее время проводятся многочисленные исследования в области биохимии онкологического процесса. Показано, что липиды, в частности фосфолипиды, и ферменты их метаболизма могут являться маркерами как наличия опухолей, так и эффективности терапии.
Цель исследования — сравнительная оценка состава фосфолипидов крови онкологических больных с опухолями различной локализации, анализ состава фосфолипидов в плазме крови больных раком молочной железы на фоне терапии.
Материалы и методы. Объектом исследований служила плазма крови больных раком молочной железы до и после лечения (21 образец), раком лёгкого (23 образца), а также плазма крови больных со злокачественными новообразованиями головного мозга (21 образец) с гистологически подтвержденным диагнозом. На основании клинико-инструментального обследования и с учетом постхирургической классификации опухолей у больных установлена II и III стадия заболевания. Контролем служила плазма крови практически здоровых доноров.
Липиды плазмы экстрагировали по методу Фолча. Состав фосфолипидов анализировали методом ТСХ в системе растворителей хлороформ:метанол:вода (65:25:4). Для количественной оценки относительного содержания фосфолипидов пластинки, обработанные 5% раствором фосфорно-молибденовой кислоты, сканировали. Затем при использовании программы One—Dscan Version 1. 3 оценивали процентное содержание каждой фракции. В экстрактах плазмы крови идентифицированы фосфатидилэтаноламин (ФЭА), фосфатидилхолин (ФХ), сфингомиелин (СМ), лизофосфатидилхолин (ЛФХ).
Результаты. В плазме крови больных раком молочной железы, раком легкого, а также пациентов с опухолями головного мозга наблюдали тенденцию к снижению лизофосфатидилхолина и накоплению фосфатидилхолина по сравнению с показателями плазмы практически здоровых доноров. При раке молочной железы и раке легкого отмечено сниженное содержание ФЭА по сравнению с таковым в плазме крови доноров. Уровень СМ в крови больных с опухолями различной локализации практически не отличается от такового в контроле.
До лечения в крови онкологических больных наблюдается тенденция к снижению ЛФХ, СМ и повышению ФХ, а также достоверное снижение ФЭА. На фоне лечения происходит достоверное повышение ЛФХ, СМ, ФЭА и снижение ФХ в плазме крови больных РМЖ до контрольного уровня. Таким образом, результаты подтверждают данные клинических исследований об эффективности терапии.
Соотношения отдельных фракций фосфолипидов в биосубстратах, в частности ФЭА/ФХ, ЛФХ/ФХ, могут косвенно свидетельствовать об интенсивности метаболизма фосфолипидов и степени их окисления. Показано снижение индекса ЛФХ/ФХ (степень окисления фосфатидилхолина) у онкологических больных по сравнению с контролем. Наблюдали также тенденцию к снижению индекса ФЭА/ФХ по сравнению с контролем независимо от типа опухоли. В плазме крови больных РМЖ после лечения отмечено достоверное повышение индекса ЛФХ/ФХ и ФЭА/ФХ по сравнению с показателями до лечения.
Заключение. В крови пациентов со злокачественными новообразованиями молочной железы, головного мозга и лёгкого не отмечено существенных изменений содержания отдельных фракций фосфолипидов, но снижается соотношение ЛФХ/ФХ, что свидетельствует об активном использовании ЛФХ в биосинтезе ФХ и катаболическом распаде ЛФХ. При эпителиальных типах рака (РМЖ и РЛ) снижается содержание ФЭА, а также соотношение ФЭА/ФХ, что может быть связано с активацией окисления ФЭА. После лечения в крови больных раком молочной железы происходит нормализация фосфолипидного спектра крови. Данные показатели находятся на уровне практически здоровых доноров. Эти изменения свидетельствуют о компенсаторной перестройке мембран клеток в ответ на лечение опухоли и об эффективности терапии.
По всей видимости, именно анализ соотношения отдельных фракций фосфолипидов может быть использован для диагностики онкологических заболеваний.
С.А. Дерявый, Е.Н. Сенина, Ю.С. Градыкина, К.Э. Крощухина, К.С. Яшин
Свободнорадикальная активность крови в патогенезе глиом
Руководитель работы Л.М. Обухова, д.б.н., доцент кафедры биохимии им. Г.Я. Городисской НижГМА
Нижегородская государственная медицинская академия
Концентрация активных форм кислорода является одним из патогенетических факторов канцерогенеза (Шайн, 2004). Однако свободнорадикальная и антиоксидантная активность в малигнизированных клетках и биологических жидкостях различается в зависимости от вида и стадии злокачественных новообразований.
Цель — исследование свободнорадикальной активности и компонента антиоксидантной защиты каталазы крови при глиомах.
Материалы и методы. Исследована кровь 8 пациентов с глиомами головного мозга до проведения противоопухолевого лечения. Контрольную группу составили 10 практически здоровых людей. Свободнорадикальную активность плазмы крови оценивали методом индуцированной биохемилюминесценции (Кузьмина и др. , 1983) на биохемилюминометре БХЛ-07, сопряженном с компьютером IBM. Метод основан на разложении перекиси водорода ионами металла с переменной валентностью с вступлением образующихся радикалов в реакцию активации свободнорадикального окисления в биологическом субстрате, что приводит к образованию тетроксида, распадающегося с выделением кванта света, регистрируемого на БХЛ-07. Активность каталазы эритроцитов определяли методом Beerand Sizer (1952), основанном на убыли оптической плотности в области светопоглощения пероксида водорода при 240нм. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета Biostat 4.3.
Результаты. Свободнорадикальная активность плазмы крови значимо возрастала (в 1,5 и более раз) при всех стадиях глиом головного мозга по сравнению с практически здоровыми людьми. Развитие бластоматозного процесса сопровождается повышением уровня супероксидного анион-радикала и других активных форм кислорода, развитием в организме состояния окислительного стресса (Miki, 2007).
Существует гипотеза, предполагающая участие активных форм кислорода, в частности супероксидного радикала и пероксида водорода, в регуляции пролиферации клеток (Меньщикова и др., 2008).
Активность каталазы эритроцитов у пациентов с глиомами также значимо превышала таковую у практически здоровых людей (в 1,7 раза). Известно, что активность каталазы в клетках глиом значительно выше, чем в нормальных астроцитах (Smith et al., 2007). Предполагается (Khoo et al., 2013), что изменение активности этого антиоксидантного фермента в клетках опухолей мозга может иметь большое значение при таргетной терапии.
Выводы. Определение активности каталазы эритроцитов с одновременным анализом свободнорадикальной активности плазмы крови может быть использовано в целях диагностики и оценки эффективности терапии глиом.
С.В. Фуфлыгина
Дисперсия электропроводности живых тканей как способ оценки их жизнеспособности
Руководители работы А.А. Гаврилова, к.б.н., О.В. Вавина, к.в.н.
Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия
Довольно точным методом оценки физиологического состояния биологического объекта является измерение некоторых электрофизиологических показателей, в частности дисперсии электропроводности, основные закономерности которой были изложены Б.Н. Тарусовым еще в 1968 г. Известно, что низкочастотное сопротивление ткани используется как критерий оценки жизнеспособности тканей при трансплантации (Опритов В.А. и др., 1991). Важным показателем является коэффициент К, показывающий, во сколько раз сопротивление при частоте 104 Гц отличается от сопротивления при 106 Гц: К=R104/R106.
Цель исследования — определение дисперсии электропроводности тканей в норме и при повреждении.
Материалы и методы. В качестве объектов исследования были взяты образцы растительных тканей кабачка и тыквы. Дисперсию электропроводности тканей измеряли методом мостовых схем (Чурмасов А.В., Хохолина Т.В., 2001). Принципиальная мостовая схема для измерения импеданса состояла из измерительного моста, низкочастотного генератора и осциллографа.
Результаты. Электрическое сопротивление растительной ткани определяли при частотах 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 5·104, 105, 2·105 Гц. В качестве повреждаемых факторов выбрали температурный (нагревание путем помещения ткани в горячую воду на 10 мин, СВЧ-печь (при Р=800 Вт в течение 1 мин) или морозильную камеру (2–4°С, 30 мин), гниль мокрая бактериальная, СВЧ-излучение низкой интенсивности (мощность Р=0,01 мВт, частота f=2450 МГц в течение 1, 2 и 3 ч). Измерения проводили в трех повторностях.
В норме перелом кривой дисперсии, равный 2, наблюдался у кабачков при частоте 105 Гц. При поражении плодов гнилью, обусловленной неправильным хранением, уже при самых низких частотах (50 Гц) сопротивление отличалось от нормы в 16,7 раза: R50н/R50г=16, 7. Поскольку установка не позволяла делать замеры при 106 Гц (самой высокой частотой была 2·105 Гц), коэффициент К рассчитывался для частот 104 и 2·105 Гц. Ткани кабачка были наиболее чувствительны к изучаемым факторам, вплоть до отмирания. Так, при поражении гнилью, помещении в кипяток и СВЧ-печь коэффициент К при 104 и 2·105 Гц равнялся 1: К=R104/R2·105=1, в норме К=R104/R2·105=4,6, а при одночасовом, двухчасовом и трехчасовом низкоинтенсивном СВЧ-воздействии коэффициент К находился вблизи контрольных значений — 4; 3,2 и 4,3 соответственно. При чем при 2-часовой обработке наблюдалась «разбалансировка» — показания были неустойчивыми и спутанными.
При исследовании ткани тыквы оказалось, что перелом кривой дисперсии также происходит при частоте 105 Гц. Но по сравнению с данными кабачка в норме при низкой частоте (50 Гц) и высокой частоте (2·105 Гц) эти данные несколько отличались: R50нк/R50нт=1, 36; R2·105нк/R2·105нт=0,93. Для тыквы коэффициент К=R104/R2·105=4,3. Перелом кривой дисперсии для гнилой тыквенной ткани и при охлаждении происходил при той же частоте, что и для неповрежденной, 105 Гц, и лишь при воздействии кипятка он смещался к 5·104 Гц. Обработка мощным СВЧ-полем приводила к полной потере жизнеспособности. Нетепловое СВЧ-излучение сначала снижало коэффициент до 2,3 (при одночасовом воздействии), а затем, с увеличением длительности воздействия, повышало до 3,3 при 2 ч обработки, а при 3-часовом — почти до нормы, 4,2. Перелом кривой дисперсии при таком воздействии в основном происходил так же, как и для нормальной ткани при 105 Гц.
Выводы. Дисперсия электропроводности тканей зависит от физиологического состояния ткани, от вида и степени воздействия. Электрическое сопротивление растительной ткани определяется видовой принадлежностью. Высокотемпературное воздействие заметно снижает жизнеспособность тканей, мощное СВЧ-воздействие на оба вида тканей действовало подавляюще. Напротив, низкоинтенсивное СВЧ-воздействие иногда оказывает на электрофизиологическую функцию ткани восстанавливающее действие, доводя коэффициент К до контрольного значения или слегка превышая его.
А.С. Кулаткова
Некоторые особенности производства экспериментальных образцов йогурта с применением порошка льняных семян
Руководитель работы Р.В. Гиноян, к.т.н., д.с.-х.н., профессор
Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия, Нижегородский референтный центр Россельхознадзора
В последние годы активизировались научные исследования с рекомендациями по организации производства кисломолочных продуктов массового употребления за счет обогащения их натуральными наполнителями, обладающими функциональными и профилактическими свойствами, а также повышенной пищевой и биологической ценностью. Анализ крови показывает недостаточное количество «Омега-3» у людей, страдающих гиперактивностью, рассеянным склерозом, аллергией, аутоиммунными заболеваниями, раком предстательной железы. С помощью некоторых пищевых добавок, содержащих кислоты «Омега-3», были достигнуты хорошие результаты в лечении заболеваний, связанных с тяжелыми депрессивными состояниями, социофобией, суицидальными наклонностями, шизофренией и другими расстройствами нервной системы.
Химическая структура «Омега-3» жирных кислот делает их неустойчивыми, легко подвергающимися окислению и повреждению, а в таком состоянии они приносят нашему организму скорее вред, чем пользу, поэтому нами в качестве пищевой добавки, содержащей «Омега-3» жирные кислоты (22,8 мг в 100 г семян), при производстве экспериментальных образцов йогурта применялся порошок льняных семян (в таком состоянии полиненасыщенные жиры более стабильны).
Цель исследования — разработка методики внесения порошка льняных семян при производстве экспериментальных образцов йогурта. Порошок применяли после специальной подготовки по разработанной нами технологии («Ноу-Хау»).
Материалы и методы. Объектами исследований служили йогурты:
- йогурт натуральный без добавок (контроль);
- йогурт натуральный с порошком льняных семян (опыт 1).
Экспериментальные образцы йогурта готовили с использованием закваски YO-MIXTMLYO 250 DCU. Термофильная молочная культура содержит Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus. Проанализировав литературные источники, приняли решение для экспериментальных образцов йогурта использовать среднюю суточную норму для человека 1,5-2,0 мг «Омега-3», что в расчете для порошка льняных семян составляет для опыта 1 — 3,2 г порошка. Этот объем порошка вносили в молочную основу одновременно с закваской из расчета на 400 г готового продукта (йогурта). Определение физико-химических (содержание абсолютного сухого вещества, влаги, жира, золы, белка) и микробиологических показателей в контрольном и опытном образцах йогурта проводили стандартным способом по общепринятым методикам в ИЦ «Нижегородиспытания» (2014 г.).
Результаты. Незначительное увеличение содержание жира, в опытных образцах йогурта (табл. 1) является положительным фактором и обеспечивает суточную норму «Омега 3» для человека, с ними организм получает и жирорастворимые витамины.
Таблица 1
Физико-химические показатели йогурта
| Образцы йогурта | Сухое вещество, % | Влага, % | Жир, % | Белок, % | Зола, % |
| Контроль | 14,80±0,2 | 85,10±0,3 | 2,5±0,1 | 3,2±0,2 | 7,90±0,2 |
| Опыт 1 | 15,60±0,3 | 84,40±0,3 | 2,8±0,2 | 3,2±0,3 | 8,10±0,1 |
В таблице 2 представлены результаты испытаний йогурта на микробиологические показатели.
Таблица 2
Микробиологические показатели йогурта
| Образцы йогурта | БГКП | КМАФАнМ, КОЕ/г | Молочнокислые бактерии, КОЕ/г | Плесени, КОЕ в 1 г, не более |
| Контроль | не обнаружены | 1,0×103 | 1,1×109 | 4 |
| Опыт 1 | не обнаружены | 1,2×103 | 1,0×109 | 5 |
Органолептические оценки образцов йогурта проводились при участии преподавателей и студентов кафедры технологии переработки продукции животноводства Нижегородской ГСХА, образцы получили положительную высокую оценку.
Выводы. Экспериментальные образцы йогуртов имеют высокую биологическую ценность; по внешнему виду, консистенции, вкусу, запаху и цвету, а также по физико-химическим и микробиологическим показателям соответствуют требованиям ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции» и ГОСТ 31981-2013 «Йогурты. Общие технические условия». При организации производства йогуртов по рекомендуемой технологии в промышленных масштабах можно обеспечить ежедневную потребность человеческого организма в полиненасыщенных жирных кислотах «Омега-3».
Е.С. Плеханова1, И.А. Чернигина2
Новый способ лечения опухолей на основе фотодинамической терапии в условиях экспериментальной неоплазии
Руководитель работы Т.Г. Щербатюк, д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологии ГБОУ ВПО НижГМА
1ФГАОУ ВО «Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского», 2ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»
Фотодинамическая терапия (ФДТ) применима в основном к онкологическим заболеваниям ранней стадии развития, но ее эффективность невысока из-за ряда недостатков. Нами предлагается усилить фотодинамическое воздействие за счет интенсификации в опухолевой ткани окислительного стресса медицинским озоном.
Цель исследования — разработать новый способ повышения эффективности фотодинамической терапии за счет комбинирования с медицинским озоном в условиях экспериментальной неоплазии.
Материалы и методы. Белые нелинейные крысы с трансплантированной карциномой почки РА разделены на три группы: «ФДТ» (n=4), «ФДТ+О3» (n=3) и «контроль» (n=4). Исходные объемы опухоли были небольшие (до 0,5 см3). При ФДТ интратуморально вводили 0,3% раствор препарата «Фотосенс» (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Россия) и в течение 6—12 ч после инъекции воздействовали светодиодным лазером (λ=660±10 нм, P=100 мВт/см2). Всего проведено два сеанса ФДТ на 15-е и 19-е сутки после перевивки.
Животным группы «ФДТ+О3» с 10-х суток после трансплантации внутрибрюшинно вводили по 0,5 мл озонированного физиологического раствора с концентрацией озона в озоно-кислородной смеси 400 мкг/л (курс 10 дней). Противоопухолевый эффект оценивали по коэффициенту абсолютного прироста опухоли (К≥0 — продолженный рост опухоли, –1≤К<0 — опухолевая регрессия).
Результаты. После ФДТ опухолевая регрессия наблюдалась в 2 случаях из 4, а при комбинированном воздействии — во всех случаях (3 из 3). У животных в группе контроля спонтанная регрессия трансплантированной карциномы не наблюдалась.
Выводы. Разработанная экспериментальная схема лечения опухолей, основанная на комбинированном действии фотодинамической терапии с озонированным физиологическим раствором с концентрацией озона в озоно-кислородной смеси 400 мкг/л, более эффективна при исходно небольших размерах опухоли по сравнению с ФДТ.
А.С. Митюкова, М.И. Яшанова
Поиск маркеров окислительного стресса при доброкачественных новообразованиях репродуктивной системы у женщин
Руководители работы Т.Г. Щербатюк, профессор, д.б.н., заведующий кафедрой биологии ГБОУ ВПО НижГМА, Л.В. Боровкова, профессор, д.м.н., заведующий кафедрой акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО НижГМА
Нижегородская государственная медицинская академия
В структуре гинекологических заболеваний миома матки и эндометриоз занимают второе и третье место, уступая лишь воспалительным процессам матки и ее придатков. Несмотря на широкую распространенность доброкачественных новообразований репродуктивной системы, их патогенез до конца не изучен. Исходами этих заболеваний могут быть бесплодие и перерождение в злокачественные новообразования.
При формировании воспалительных заболеваний, предопухолевых и опухолевых процессов матки и придатков особое место отводится развитию окислительного стресса. Однако имеются противоречивые данные по нарушению про-антиоксидантного баланса у больных с доброкачественными новообразованиями (Коваленко Т.Д., 2006; Коровушкина К.А., 2010 и др.). Существует несколько десятков биохимических параметров, характеризующих состояние окислительного стресса, и оптимальным решением было бы визуализировать биохимические процессы. К такому методу визуализации относится метод клиновидной дегидратации.
Цель исследования — изучить активность свободнорадикальных процессов у женщин с эндометриозом и миомой матки, провести корреляционный анализ структур фаций крови с параметрами окислительного стресса.
Материалы и методы. Исследована кровь 36 человек, 27 из которых — больные с доброкачественными новообразованиями: эндометриозом и миомой матки; и 9 здоровых волонтеров, составивших группу контроля. Для биохимического анализа использовали плазму крови. Общую свободно-радикальную и антиоксидантную активность определяли методом индуцированной хемилюминесценции (Кузьмина Е.Н., 1983). Интенсивность процесса перекисного окисления липидов оценивали по концентрации малонового диальдегида (МДА) (Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., 2000). Для визуализации биохимических процессов использовали метод клиновидной дегидратации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001). Обработка данных проводилась с помощью программы Statistica 8.0 с применением методов непараметрической статистики (критерий Манна-Уитни и корреляционный анализ Спирмена).
Результаты. У пациентов с доброкачественными новообразованиями репродуктивной системы было установлено усиление интенсивности хемилюминесценции (Imax) на 37% на фоне снижения общей антиоксидантной активности (1/S) на 50%. Кроме того, зарегистрировано повышение концентрации МДА на 80% по сравнению со здоровыми волонтерами (p<0,05).
При анализе структуропостроения фаций плазмы крови методом клиновидной дегидратации было обнаружено отличие между кристаллическими структурами фаций волонтеров и больных. У здоровых волонтеров визуализировались три зоны: периферическая, промежуточная и центральная; большое количество радиальных и параллельных трещин, оформленные конкреции. У пациенток с доброкачественными новообразованиями выявлено уменьшение радиальных и параллельных трещин, увеличение угловых трещин, включений, темный ореол у конкреций, появления трещин специфической формы. Была установлена обратная зависимость между количеством параллельных трещин и Imax; количеством трещин «черная сеть», количеством включений и 1/S; прямая зависимость между количеством параллельных трещин и 1/S, количеством включений и Imax. В группе пациенток с доброкачественными новообразованиями дополнительно была установлена положительная корреляция размера трещин с показателем 1/S и количества трещин типа «жгут» с Imax.
Выводы. У женщин с доброкачественными новообразованиями повышена интенсивность хемилюминесценции (37%) на фоне снижения общей антиоксидантной активности (50%), увеличена концентрация МДА (80%); изменена кристаллическая структура капли плазмы крови по сравнению с данными здоровых (увеличение количества листов, угловых трещин, включений, количества трещин в центральной зоне, темный цвет у конкреций, уменьшение радиальных трещин). Установлена корреляционная зависимость между биохимическими параметрами (Imax, 1/S) и кристаллической структурой плазмы крови.
А.В. Шумилова, А.В. Дерюгина
Применение цитофлавина для коррекции окислительного стресса и гемоциркуляции при черепно-мозговой травме в эксперименте
Руководитель работы А.В. Дерюгина, д.б.н., доцент кафедры биохимии и физиологии ИББМ
ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
По современным представлениям, в патогенезе черепно-мозговой травмы (ЧМТ) одно из важных мест наряду с первичным травматическим поражением нервной ткани занимает ее вторичная травматизация каскадом биохимических, иммунологических и защитно-приспособительных реакций, возникающих на фоне функциональных и морфологических изменений в мозговой ткани, кровеносной, дыхательной и ликвородинамической системах. Поэтому на одно из первых мест выходит свободно-радикальное перекисное окисление липидов мембран клеток на фоне срыва ауторегуляции гемоциркуляции тканей черепной коробки. В связи с этим актуальной задачей терапии является поиск эффективных нейропротекторов, способствующих поддержанию данного процесса на адаптивном уровне.
Цель исследования — изучение динамических изменений продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах и плазме крови, а также электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ) при моделировании ЧМТ крыс.
Материалы и методы. Исследование проведено на 18 белых нелинейных крысах-самцах, массой 180–200 г, по 6 крыс в каждой группе. Животных фиксировали на планшете и моделировали ЧМТ путем свободного падения груза массой 100 г с высоты 80 см на теменно-затылочную область мозга.
Опытной группе в течение 12 дней вводили цитофлавин. Первое введение препарата осуществляли через 1 ч после нанесения ЧМТ, а в течение последующих 10 дней ежедневно внутрибрюшинно в дозе 0,2 мл/кг массы тела. Контрольной группе вводили физиологический раствор в том же объеме. Уровень физиологической нормы определяли у интактных животных.
Забор крови у всех групп животных производили из подъязычной вены на 1, 3, 7-е и 12-е сутки после альтерации. Анализировали электрофоретическую подвижность эритроцитов методом микроэлектрофореза, концентрацию малонового диальдегида в эритроцитах по реакции с тиобарбитуровой кислотой и содержание продуктов пероксидации липидов в плазме — диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК) и оснований Шиффа (ОШ) спектрофотометрически. Полученные результаты обрабатывали при помощи программ Microsoft Excel 2010 и Biostat.
Результаты исследования. ЧМТ сопровождалась уменьшением электроотрицательности мембран эритроцитов и усилением оксидантных процессов в эритроцитах и плазме крови. При действии цитофлавина наблюдалась нормализация исследуемых показателей. С третьих суток посттравматического периода происходило увеличение ЭФПЭ на 44, 55% относительно контрольной группы. Дальнейшее нарастание ЭФПЭ и восстановление до значений интактной группы происходило на фоне относительного снижения концентрации продуктов пероксидации липидов. Так, в эритроцитах к 7-м суткам регистрировалось падение концентрации МДА на 64,71% относительно контроля, в плазме значимо снижалась концентрация ДК, ТК и ОШ на 55,56, 40,0 и 10,84% соответственно относительно контроля, в котором эти показатели оставались повышенными.
Выводы. Применение универсального цитопротектора — цитофлавина, обладающего антиоксидантной и антигипоксантной активностью, при лечении ЧМТ является патогенетически обоснованным уже с первых часов травмы. Достоверно установлено, что цитофлавин ингибировал развитие окислительного стресса на уровне ДК, ТК, прерывая синтез ОШ. Повышение ЭФПЭ, отражая увеличение электроотрицательности клеток, косвенно свидетельствует об улучшении реологического состояния крови и микроциркуляции. Наиболее выраженное действие цитофлавина проявилось на промежуточном этапе посттравматического периода (3—7-е сутки после ЧМТ).
А.Г. Высоцкая
Состояние прооксидантной системы и морфологической картины у студентов-первокурсников в условиях психоэмоционального стресса
Руководитель работы Т.Г. Щербатюк, д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологии НижГМА
Нижегородская государственная медицинская академия
В настоящее время активно проводятся исследования этнических особенностей неспецифических реакций организма, лежащих в основе адаптационно-компенсаторных механизмов. Известно, что любая стрессорная реакция как результат развертывания адаптационного процесса сопровождается развитием окислительного стресса, поэтому выяснение особенностей процессов свободнорадикального окисления — антиоксидантной защиты представляет важность для раскрытия закономерностей формирования адаптивных реакций на клеточном уровне. Экзаменационный стресс занимает одно из первых мест среди причин, вызывающих психическое напряжение у учащихся высшей школы, что может отразиться на процессах адаптации и сопровождается выраженной картиной метаболических изменений.
Цель исследования — изучить изменение под действием психоэмоционального стрессора свободнорадикальных процессов и особенности морфологической структуры слюнной жидкости у студентов-первокурсников разных этнических групп.
Материалы и методы. В исследовании приняли участие 70 студентов в возрасте 19±1 лет. По этнической принадлежности было сформировано три группы — русские, индусы и африканцы; в качестве биологического материала использовалась слюнная жидкость. Изучение материала проводилось методами индуцированной хемилюминесценции и клиновидной дегидратации.
Результаты. На основании предэкзаменационных значений интенсивности хемилюминесцентного свечения слюнной жидкости внутри каждой этнической группы были установлены три категории: имеющие низкий (0–0,35); средний (0,35–0,5); высокий (≤0,5) уровень свободнорадикального окисления. У студентов с высоким предэкзаменационным хемилюминесцентным свечением была установлена этническая зависимость: под влиянием стрессора русские студенты продемонстрировали повышение уровня свободнорадикального окисления, у африканцев и индусов наблюдалось его снижение.
При изучении морфологической картины слюнной жидкости были выделены четыре категории фаций, характерные для волонтеров независимо от этнической принадлежности; в ходе исследования мы выявили, что процент встречаемости вышеперечисленных типов фаций отличается у студентов разных этнических групп.
Выводы. На основании полученных данных мы можем предполагать слабую способность адаптироваться к условиям психоэмоционального стресса русских и индийских студентов; в то же время африканские студенты продемонстрировали реакцию стимуляции на фоне влияния экзаменационного стресса.
М.И. Яшанова, Е.С. Стулова, А.Г. Высоцкая
Возможность ограничения окислительного стресса у крыс с экспериментальным диабетом саксаглиптином
Руководитель работы Т.Г. Щербатюк, д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологии НижГМА
Нижегородская государственная медицинская академия
Высокие темпы роста заболеваемости сахарным диабетом (СД) и увеличение смертности от его осложнений обуславливают необходимость изучения патогенеза данного заболевания. Ведущую роль в патогенезе СД и развитии его осложнений отводят окислительному стрессу. Именно поэтому в терапии СД необходимо использовать препараты, обладающие не только антигипергликемическими свойствами, но и антиоксидантными.
Цель исследования — оценить антиоксидантные свойства препарата нового поколения из класса ИДПП4 — саксаглиптина.
Материалы и методы. Эксперимент проведен на 30 белых нелинейных крысах-самцах. Модель стрептозотоцинового СД с высококалорийной диетой (STZ-20) воспроизводили по схеме S. Islam и H. Choi. Сахарный диабет устанавливался по уровню глюкозы крови натощак. Группу сравнения составляли здоровые животные. На части животных изучали действие саксаглиптина (Онглиза) в течение 14 дней.
Концентрацию глюкозы определяли с помощью глюкометра Optium Xceed. Общую антиоксидантную и свободно-радикальную активность оценивали по уровню хемилюминесценции плазмы крови по методу Е.И. Кузьминой. Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) измеряли по содержанию в плазме крови молекулярного продукта — малонового диальдегида (МДА) по методу А.В. Арутюнян и Е.Е. Дубининой. Степень ОМБ определяли по уровню карбонильных производных по методу А.В. Арутюнян, Е.Е. Дубининой. Для оценки активности СОД и каталазы применяли методы М. Nishicimi и Н. Aebi. Также в исследовании использовался метод клиновидной дегидратации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н.).
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы Statistica 8.0, с применением методов непараметрической статистики.
Результаты. Через 6 дней после введения стрептозотоцина у крыс наблюдалось стойкая гипергликемия, что свидетельствовало о развитии диабета. Общая свободнорадикальная активность (Imax) и концентрация МДА были достоверно повышены на 7 и 17% соответственно, по сравнению со здоровыми животными, что свидетельствует об усилении окислительной деструкции липидов. Также было увеличено содержание всех продуктов ОМБ, а именно КДНФГ и АДНФГ при спонтанном окислении на 43 и 25%, КДНФГ и АДНФГ при металл-индуцированном окислении на 18 и 12%. При оценке активности антиоксидантных ферментов у крыс с экспериментальным диабетом не наблюдалось статистически значимого изменения активности СОД, при этом активность каталазы была повышена на 59%.
После 14-дневного воздействия саксаглиптином было показано снижение гипергликемии по сравнению с группой контроля (СД без воздействия), однако ее значения не достигали нормогликемии. При этом саксаглиптин оказывал нормализующее действие на максимальную интенсивность хемилюминесценции (Imax) и концентрацию МДА. Также наблюдалось снижение концентрации продуктов спонтанного окисления белков. При этом содержание продуктов металл-индуцированной модификации белков после воздействия препаратом и без воздействия (контрольная группа) не отличалось и превышало значения данных параметров у здоровых животных. Изменение активности каталазы было неоднозначным у всех животных после воздействия. У части из них активность данного фермента была снижена (43%), у остальных повышена относительно группы животных с СД без воздействия.
Для визуализации биохимических процессов использовался метод клиновидной дегидратации. Применение корреляционного анализа Спирмена выявило статистически значимую взаимосвязь количественного анализа кристаллической структуры фации (наличие и размер «радиальных», «арковых», «угловых», «штриховых» трещин на периферии, «круглых конкреций», трещин в центральной зоне) с параметрами про- и антиоксидантной системы (Imax, КДНФГс, АДНФГс, КДНФГи, АДНФГи, активность СОД и каталазы).
Выводы. Воздействие саксаглиптина в течение 14 дней привело к нормализации интенсивности хемилюминесценции, концентрации МДА, продуктов спонтанной модификации белков в крови крыс с экспериментальным СД, однако не влияло на концентрацию продуктов металл-индуцированной модификации белков.
Наблюдались статистически значимые корреляционные взаимосвязи между биохимическими параметрами и структурами фаций крови, которые позволяют говорить о возможности применения клиновидной дегидратации для оценки эффективности антигипергликемических препаратов.
Ya.A. Guryanova, E.A. Kulagina, I.A. Chernigina
A rapid and affordable method of estimating DNA damage and repair
Shcherbatyuk, professor, the head of the Biology department
Nizhny Novgorod State Medical Academy, Russia
The number of found factors damaging cell DNA increases recently. To understand the impact of these new factors it is necessary to have simple method of estimating the impact level. The so called Comet assay is useful for this purpose but its general limitation is the use of gamma radiation breaking DNA molecules in the places where damage appears under the effect of various factors.
In frame of this project we developed alternative method utilizing ozone with concentration 200 to 1000 µg/l instead of gamma radiation. The diffusion level of DNA comet tail under 10 min impact of ozone with concentration of 900 µg/l was 12,4±0,8% being close to that under gamma radiation of Co-60 with dose of 3 Grays (12,1±0,8%). Besides that the impact time was shortened 18 times.
The samples of peripheral blood were studied to develop this method for volunteers exposed by various factors: smoking, acclimation, hypernutrition, solarium visiting and food restriction and group without any impact.
To analyze cells of capillary blood we prepared slides in agarose gel. DNA decay was carried out by slide processing in PBS with pH 7,4 to 7,5 saturated by ozone-oxygen mixture at ozone concentration 900 µg/l for 5 min. The reliability of results was estimated using the parametric statistics.
The significant decreasing of DNA damage level from 30 to 2,5% was found in the row noted above. This can be explained by the decreasing of the express concentration of free radicals corresponding to the impact. Then we studied DNA repair and found that smoking and acclimation factors also result in least repair levels: 73,5 and 82,7% correspondingly. Thus the proposed method allows detecting rapidly the dangerous factors affecting DNA damage and estimating the resistance of human organism to these factors.
O.V. Smetanina, N.K. Belskaya, I.A. Chernigina
A new rapid diagnostic method for detecting free-radical pathologies
Shcherbatyuk, professor, the head of the Biology department
Nizhny Novgorod State Medical Academy, Russia
The free-radical pathologies (FRP), including cardiovascular diseases, diabetes and cancer, were the leading causes of population mortality in 2014 according to the WHO data. The grade of DNA damage in individual cells by measuring the diffusion of the tail of a comet (known as Comet assay) can be used as FRP indicator. At present the main bottleneck for wide application of this method in clinical study is the use of hi-tech equipment utilizing gamma radiation.
The use of ozone with concentration 200 to 1000 μg/l in ozone-oxygen mixture presented in the Project is an alternative to gamma radiation. The level of thediffusion of the tails of a comets were about 12,43±0,79% when exposed to ozone at a concentration of 900 μg/l for 10 minutes. It is comparable to the exposition to Co-60 gamma radiation at a dose of 3 Gy (12,1±0,81%). In addition to gamma radiation elimination the exposure of sample is reduced by 3 hours. This fact makes this method the rapid tool for detection of activity of free-radical processes and, consequently, free-radical pathologies. It was also found in the experiment with rats carrying a tumor strain of cholangioma PC1 that the level of the diffusion of the tails of a comets of blood cells is 3,66±0,27% at early stage of tumor growth and 11,80±1,26% at a late stage.
Thereby we developed a new method of creating DNA damage for comet tests allowing its wide implementation in screening programs to detect risk groups with FRP. Rapid procedure and simplified requirements to the equipment and personnel allow using this method in local hospitals analyzing millions samples per year. Early revealing of malignant tumors can introduce individual treatment programs and relieve suffering from chemotherapy for more than 400 thousand people a year.